油包油型辣椒素乳劑的制備與體外透皮研究

鐘 仲 楊棣華 麥蘊華

1.廣東省佛山市禪城區(qū)人民醫(yī)院藥械科，廣東佛山 528000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510006

慢性瘙癢是許多皮膚病伴隨的癥狀，且往往難以治療。 辣椒素（C18H27NO3），又名辣椒堿、辣椒辣素，是從辣椒中提取的一種具有揮發(fā)性和刺激性的香草酰胺類生物堿，是辣椒總堿中含量最高的一種，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗肥胖、緩解疼痛和慢性瘙癢等多種藥理活性[1-7]。 辣椒素作為一種治療慢性疼痛和瘙癢的傳統(tǒng)藥物， 其作用機制是競爭性抑制辣椒素受體（transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1），使節(jié)前纖維對各種物理刺激、內(nèi)源性、外源性化學(xué)刺激和炎癥因子刺激無應(yīng)答[8]。 辣椒素與TRPV1 的結(jié)合，最初會引起疼痛和灼燒，持續(xù)使用后，神經(jīng)元的去功能化導(dǎo)致其持久緩解疼痛和瘙癢。 陳丹等[9]研究發(fā)現(xiàn)，梅花針刺聯(lián)合辣椒素和積雪苜軟膏能明顯抑制燒傷患者的瘙癢。 有文獻(xiàn)報道顯示，8%的辣椒堿貼劑用于治療短期和中期的神經(jīng)性疼痛均有較好的效果[10]。 目前市售辣椒堿主要以0.025%～0.1%含量的乳劑為主，劑量較低，且乳劑在皮膚上停留時間短，需每日多次給藥，限制了其應(yīng)用[11]。

油包油型乳劑是將親脂性藥物溶解在一種油中并分散在另外一種不相溶的油中形成的一種新型制劑[12-15]。 這種包裹住載藥油的乳劑在皮膚上形成一層水不溶性薄膜，API 通過擴散傳遞到皮膚， 具有含藥量高、釋放緩慢、滲透率恒定等特點。高壓均質(zhì)法是制備乳劑的一種常規(guī)方法，具有操作簡單和效率高的特點[16]。 本研究采用二甲基硅油和蓖麻油作為兩種油相，以聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X100）作為表面活性劑[13]，利用高壓均質(zhì)機制備油包油型辣椒素乳劑，采用正交試驗， 制備釋放性能較好的辣椒素乳劑，并以右旋糖酐致小鼠瘙癢模型研究其藥效，擬開發(fā)一種新型緩解瘙癢癥的外用制劑。

1 實驗材料

1.1 儀器

AH00D 納米高壓均質(zhì)機（ATS）；U3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo Scientific 公司）；改良Franz透皮擴散池（7 ml，3.14 cm2）。

1.2 試藥與試劑

辣椒素（武漢遠(yuǎn)城藥業(yè)，批號：201904）；辣椒素對照品（成都普思生物科技股份有限公司，純度>99.0%，批號：PS011155）；辣椒素軟膏（規(guī)格：2.5 mg/10 g，長春普華制藥股份有限公司，批號：201127）；蓖麻油（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20190815）；二甲基硅油（醫(yī)用級，美國道康寧，型號：QP1-9140，黏度：20、100、500 mPa·s）；Triton X100（美國Sigma 公司）；乙腈（色譜純）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SD 大鼠20 只、昆明小鼠24 只[雌雄各半，SPF級，來源：珠海百試通生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK（粵）2020-0051]。 本研究經(jīng)佛山市禪城區(qū)人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查，符合實驗動物倫理規(guī)范和要求。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗滿足正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，經(jīng)方差齊性檢驗滿足方差齊的數(shù)據(jù)采用Dunnett-t 檢驗進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 方法與結(jié)果

2.1 辣椒素含量測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（80:20）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

2.1.2 對照品儲備液的配制 精密稱取5 mg 辣椒素加入到10 ml 容量瓶中，乙腈定容，搖勻，即制得辣椒素對照品儲備液，濃度為500 μg/ml。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將辣椒素對照品儲備液配制成系列濃度的辣椒素對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，測定各個濃度的辣椒素對照品溶液，記錄其峰面積[17]。 以相應(yīng)進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)和峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得辣椒素低濃度和高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：低濃度Y=3528.4X-339.3，R2=0.9999；高濃度Y=7110.3X-1191，R2=0.9994。結(jié)果表明， 辣椒素在檢測濃度0.502～25.1 μg/ml和檢測濃度50.2～150.6 μg/ml 范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗 按“2.1.1”項下色譜條件，考察日內(nèi)精密度，分別制備低濃度為0.5 μg/ml、中濃度為50 μg/ml、高濃度為100 μg/ml 的辣椒素對照品溶液各3 份，過0.22 μm 濾膜后進(jìn)行進(jìn)樣測定其峰面積，見表1。結(jié)果顯示，3 種濃度峰面積RSD 分別為1.93%、0.78%、0.94%（n=3），提示日內(nèi)精密度均良好。

表1 精密度試驗結(jié)果

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.1.1”項下色譜條件，取油包油型辣椒堿乳劑接受液7 份， 分別于制備后0、2、4、8、12、24 和36 h 進(jìn)樣測定其峰面積，見表2。 結(jié)果顯示，辣椒素峰面積RSD 為1.0%（n=7）， 提示辣椒素溶液在36 h 內(nèi)比較穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.1.6 加樣回收率試驗 按處方量制備空白油包油乳劑，精密量取空白油包油乳劑的接收液1 ml 置10 ml容量瓶中，共6 份，分別精密加入辣椒素對照品儲備液100 μl，用乙腈溶液定容，搖勻，按“2.1.1”項下色譜條件各進(jìn)樣10 μl 測定其峰面積，得到待測成分的含量，計算回收率，結(jié)果見表3。 結(jié)果表明游離藥物的回收率符合要求。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

2.1.7 專屬性試驗 按“2.1.1”色譜條件，將“2.1.2”項下制備得到的辣椒素對照品溶液和空白油包油乳劑接受液進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果見圖1。

圖1 辣椒素對照品與空白油包油乳劑接受液的高效液相色譜圖

2.2 油包油型辣椒素乳劑的制備

通過高壓均質(zhì)法，以蓖麻油為內(nèi)相，硅油為外相，Triton X100 為乳化劑，制備油包油型辣椒素乳劑。 具體操作：精密稱量適量蓖麻油和Triton X100，水浴加熱至75℃，攪拌條件下加入0.5 g 辣椒素使其溶解；加入適量硅油，高速剪切5 min；隨后140 bar 條件下高壓均質(zhì)3 個循環(huán)，既得均勻的乳白色油包油型辣椒素乳劑，放入4℃冰箱保存，備用。

2.3 親水性辣椒素乳膏的制備

將十六十八醇（6%～8%）、硬脂酸（4.0%～12.0%）、凡士林、維生素E（0.5%）混勻，加熱至溶解；然后將十二烷基硫酸鈉（0.5%～2%）和丙二醇（10%）溶解在熱水中，邊攪拌邊將水相緩緩加入油相中，制成兩親性乳膏。 將10%（w/w）的辣椒素乙醇溶液加入90%（v/v）的丙二醇水溶液中，制成1%的親水性辣椒素乳膏。

2.4 體外透皮實驗

2.4.1 離體大鼠皮的前處理 取皮膚完好的大鼠，稱重，檢疫觀察3 d，第3 天頸部脫臼法處死大鼠。用電動剃毛刀剔除老鼠腹部毛后， 將腹皮和鼠體鈍性分離，刮去皮下脂肪組織、黏液組織和鼠毛，生理鹽水沖洗干凈后，涂上少量甘油，用錫紙包裹后，-20℃冷藏備用。

2.4.2 體外透皮試驗 固定大鼠腹部皮膚在供給池與接受池之間，并將皮膚角質(zhì)層面向供給池，使皮膚下層恰好接觸液面， 保證皮膚與接受液液面之間無氣泡。Franz 擴散池面積為3.14 cm2，接收池體積為7 ml，（32±1）℃恒溫水浴， 接受液為30%乙醇-生理鹽水溶液，攪拌速度為500 r/min。 將0.3 g 的油包油型乳劑涂抹在大鼠皮膚表面，在擴散池上封上封口膜，分別于18、20、22、24、26、28 h 取接收液1 ml，同時補充1 ml等溫的接收液。

經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液按“2.1.1”進(jìn)樣檢測藥物濃度Cn，并按照以下公式算出藥物單位面積累積滲透量（Qn，μg/cm2）和穩(wěn)態(tài)擴散速率[Js，μg/（cm2·h）][18]。

其中Cn、Ci分別為第n、i 個取樣點測得的藥物濃度（μg/ml）；V 為接受液體積；Vi為第i 個取樣點體積，S 為擴散滲透面積（3.14 cm2）。 以時間t 為橫坐標(biāo)，單位面積累積滲透量Qn 為縱坐標(biāo)作圖，對曲線的直線部分進(jìn)行線性回歸， 所得斜率即為穩(wěn)態(tài)擴散速率Js[μg/（cm2·h）][19-20]。

2.4.3 穩(wěn)定性 分層的快慢是衡量乳劑穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。以1000 r/min 離心5 min，加速油包油型辣椒素乳劑分層，一定時間內(nèi)觀察油包油型辣椒素乳劑是否分層。結(jié)果顯示，不分層，說明本研究制備油包油型辣椒素乳劑穩(wěn)定。

2.5 油包油型辣椒素乳劑處方優(yōu)化

油包油型辣椒素乳劑制備工藝的正交試驗，考察了蓖麻油體積∶硅油體積（A）、硅油黏度（B）、Triton X100 用量（C）三個因素對辣椒素體外釋放和穩(wěn)定性的影響。設(shè)計3 因素3 水平的L9（33）正交試驗表（表4）對乳劑的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化， 以穩(wěn)態(tài)擴散速率Js 和離心穩(wěn)態(tài)性為指標(biāo)進(jìn)行研究，結(jié)果見表5。

表4 因素水平表

由表5 中的極差值R，得知油包油型辣椒素乳劑處方制備工藝3 個影響因素順序依次為：B>A>C，說明影響依次減弱順序為：硅油黏度、相體積比、Triton X100 用量，油包油型辣椒素乳劑處方的最優(yōu)處方為：A3B3C1。即油包油型辣椒素乳劑的最佳處方：相體積比為0.5，硅油黏度為500 mPa·s，Triton X100 用量為2%。

表5 正交試驗結(jié)果

2.6 體外透皮實驗比較

選擇1%親水性辣椒素乳膏和油包油型辣椒素乳劑的最優(yōu)處方A3B3C1，按“2.4”項下方法進(jìn)行體外透皮實驗，實驗結(jié)果見圖2。 結(jié)果顯示，親水性辣椒素乳膏和油包油型辣椒素乳劑的單位面積累積滲透量Q 和時間成正比，親水性辣椒素乳膏的滲透速率快，油包油型辣椒素乳劑的滲透速率低于親水性辣椒素乳劑。Js 為（0.380±0.012）μg/（cm2·h）。

圖2 油包油型辣椒素乳劑和親水性辣椒素乳膏的體外透皮吸收曲線（n=3）

2.7 瘙癢動物模型的療效研究

為研究油包油型辣椒堿乳劑治療瘙癢的效果，將昆明小鼠24 只，隨機分為3 組，雌雄各半，每組8 只（分別為受試組、市售組和空白對照組）。 實驗前24 h用脫毛膏脫除小鼠背毛，避免損傷皮膚，觀察有無紅腫以及皮膚破損。 在受試組、市售組小鼠背部皮膚分別給予油包油型辣椒素乳劑與市售辣椒素軟膏，每天1 次， 連續(xù)3 d。 空白對照組小鼠給予等容積生理鹽水。末次給藥后用生理鹽水洗去藥物。受試組、市售組和空白對照組小鼠按1.25 mg/kg 尾靜脈注射0.025%右旋糖酐-40。以小鼠前肢抓頭部、后肢抓軀體以及嘴咬全身各部位作為瘙癢指征， 記錄30 min 內(nèi)小鼠的瘙癢次數(shù)和潛伏時間，結(jié)果見表6 及圖3。

結(jié)果顯示，受試組的潛伏時間長于空白對照組和市售組，瘙癢次數(shù)少于空白對照組和市售組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 市售組的潛伏時間長于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表6、圖3）。

圖3 油包油型辣椒素乳劑對右旋糖酐誘導(dǎo)小鼠瘙癢模型的影響（±s，n=8）

表6 油包油型辣椒素乳劑對右旋糖酐誘導(dǎo)小鼠瘙癢模型的影響（±s）

表6 油包油型辣椒素乳劑對右旋糖酐誘導(dǎo)小鼠瘙癢模型的影響（±s）

注 F 潛伏時間=80.66，P 潛伏時間<0.05，F(xiàn) 瘙癢次數(shù)=19.07，P 瘙癢次數(shù)<0.05；與空白對照組比較，aP<0.05；與市售組比較，bP<0.05

組別 潛伏時間（s） 潛伏時間的95%置信區(qū)間 瘙癢次數(shù)（次） 瘙癢次數(shù)的95%置信區(qū)間空白對照組（n=8）市售組（n=8）受試組（n=8）36.75±13.34 57.75±12.42a 121.88±15.91ab 25.60～47.90 47.37～68.13 108.58～135.17 37.00±10.03 31.13±9.34 11.50±6.05ab 28.62～45.38 23.32～38.93 6.44～16.56

3 討論

本研究通過高壓均質(zhì)法制備出一種含有辣椒素的油包油型乳劑，并通過正交實驗，優(yōu)化了油包油型辣椒素乳劑的處方，本研究結(jié)果顯示，油包油型辣椒素乳劑處方制備工藝3 個影響因素順序依次為：B>A>C，說明影響依次減弱順序為：硅油黏度、相體積比、Triton X100 用量， 油包油型辣椒素乳劑處方的最優(yōu)處方為：A3B3C1，該結(jié)果表明，相體積比和硅油黏度對于油包油乳劑的擴散系數(shù)影響大。隨著蓖麻油和硅油體積比的增加，硅油量減少，分散相降低，擴散速率增加，但會影響透皮速率。 不同黏度的硅油對擴散系數(shù)也具有顯著影響，隨著硅油黏度越高，擴散系數(shù)顯著降低，辣椒素擴散越慢，有利于辣椒素的緩慢釋放，且對乳劑的穩(wěn)定性起到了關(guān)鍵影響，所以選擇高黏度硅油。 表面活性劑Triton X100 對擴散系數(shù)基本無影響，但對于穩(wěn)定性具較大的影響，而且隨著硅油黏度增加，乳劑穩(wěn)定性顯著增加。 按照最優(yōu)條件制備油包油乳液，驗證其處方工藝，測得Js 和穩(wěn)定性。 結(jié)果優(yōu)于以上各處方，確定處方為：相體積比為0.5，硅油黏度為500 mPa·s，Triton X100 用量為2%為油包油型辣椒素乳劑的最佳處方組合。選用以上優(yōu)化的最佳處方與1%親水性辣椒素乳膏進(jìn)行體外透皮實驗， 結(jié)果顯示，親水性辣椒素乳膏和油包油型辣椒素乳劑的單位面積累積滲透量Q 和時間成正比， 親水性辣椒素乳膏的滲透速率快，油包油型辣椒素乳劑的滲透速率明顯低于親水性辣椒素乳劑，證明油包油型辣椒素乳劑釋放緩慢，可以達(dá)到持續(xù)釋放的效果；最后，選擇右旋糖酐致小鼠瘙癢模型研究市售辣椒素軟膏和油包油型辣椒素乳劑的療效， 各組小鼠30 min 內(nèi)潛伏時間和瘙癢次數(shù)的比較結(jié)果顯示，市售組和受試組小鼠的潛伏時間顯著延長，且受試組小鼠瘙癢次數(shù)下降更顯著，提示油包油型的辣椒素乳劑相比于普通辣椒素乳劑，能更有效地減少其瘙癢次數(shù)，表現(xiàn)出更好地緩解瘙癢的治療效果。

本研究成功制備了一種含有二甲基硅油和蓖麻油的油包油型辣椒素乳劑， 并對其進(jìn)行處方優(yōu)化，確定了最優(yōu)處方，并以右旋糖酐致小鼠瘙癢模型測定其藥效。 相比于傳統(tǒng)乳劑，該制劑具有劑量高、釋放緩慢、依從性好和有效降低瘙癢次數(shù)的特點。 油包油型乳劑是一種有效利用辣椒素治療慢性瘙癢的制劑方法，該方法可能會適用于其他具有皮膚刺激性和需長期給藥的藥物制劑制備。