急性冠脈綜合征大鼠外周血巨噬細胞中脂質穩態與動脈粥樣硬化指數相關性研究

南武娟，文申英

(1.咸陽市第一人民醫院，陜西 咸陽 712000；2.商洛市中心醫院，陜西 商洛 726000)

急性冠狀動脈綜合征(Acute coronary syndrome,ACS)是一組以冠狀動脈內不穩定的粥樣硬化斑塊破裂或侵襲、繼發閉塞性血栓而引發急性心肌缺血的臨床綜合征，主要包括急性ST段抬高性心肌梗死(ST-elevation myocardial infarction,STEMI)、急性非ST段抬高性心肌梗死(Non-ST-elevation myocardial infarction,NSTEMI)和不穩定型心絞痛(Unstable angina,UA)，患者常表現為發作性胸悶、胸痛、心悸、心絞痛等，可導致心律失常、心力衰竭甚至猝死，且發病率呈現逐年上升的趨勢，嚴重威脅患者的生命健康[1-2]。既往研究[3-4]表明，巨噬細胞泡沫化是ACS發生發展的重要影響因素之一，當巨噬細胞內脂質穩態平衡被打破時，即可發生巨噬細胞泡沫化，從而導致ACS的發生。動脈粥樣硬化指數(Atherosclerosis Index,AI)是動脈粥樣硬化過程中一系列危險因子和保護因子的比值，臨床研究[5]認為，AI是全面衡量動脈粥樣硬化程度的重要指標，具有極高的臨床診療應用價值。然而，關于AI與ACS及外周血巨噬細胞中脂質穩態的相關性，目前鮮有研究報道。因此，本研究旨在探究 ACS模型大鼠外周血巨噬細胞中脂質穩態與AI的關系，以期為ACS的臨床鑒別診斷提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物： 選取10只8周齡健康雄性SPF級SD大鼠，體重180～200 g，購自陜西省食品藥品檢驗研究院，許可證號：SYXK(陜)2018-002，常規飼養于恒溫恒濕潔凈動物房，正常晝夜交替，自由飲食飲水。

1.1.2 主要試劑及儀器：鹽酸異丙腎上腺素注射液(國藥準字H31021344);RPMI 1640培養基、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS，上海碧云天生物技術有限公司)；超低溫冰箱、細胞培養箱(德國Heraeus公司)；超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)；電子天平(METTLERTOLEDO公司)；石蠟組織切片機(德國萊卡公司)；光學顯微鏡(尼康儀器有限公司)；全自動酶標儀(Finnpipette公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及ACS模型建立：將20只大鼠隨機分為對照組和模型組，每組10只。模型組大鼠頭部和四肢多點皮下注射30 mg/kg鹽酸異丙腎上腺素建立ACS模型，以心電圖發生改變為造模成功標準；對照組大鼠給予皮下注射等體積生理鹽水。

1.2.2 取樣及處理：造模成功后6 h頸椎脫臼處死兩組大鼠，碘伏常規消毒，打開胸腔，斷開肋骨，無菌操作取出整個心臟和主動脈，以冰冷的無菌PBS沖洗，稱重后置于-80 ℃凍存備用。

1.2.3 心肌和主動脈組織形態學觀察：取兩組大鼠部分心肌和主動脈組織，10%甲醛溶液固定，乙醇脫水，常規石蠟包埋，切5 μm厚連續切片，HE染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察心肌和主動脈組織形態學變化。

1.2.4 心肌梗死面積比例和易損指數：取兩組大鼠部分心肌組織病理切片并稱重，沿白色梗死區域邊緣切下梗死的心肌組織，稱重，以梗死心肌組織的重量與整個心肌組織的重量之比表示心肌梗死面積比例。應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件定量測算細胞外脂質、泡沫細胞及膠原成分的含量，并按下述公式計算易損指數：易損指數=細胞外脂質+泡沫細胞/平滑肌細胞+膠原。

1.2.5 外周血巨噬細胞中脂質含量的測定：各只眼眶取血4 ml，轉移至培養瓶中，37 ℃、5%CO2培養箱中孵育2 h，待細胞貼壁生長后倒掉培養基，加適量無菌PBS輕輕洗去懸浮的細胞，再以胰蛋白酶消化并吹打重懸細胞，轉移至離心管，1000 r/min離心5 min，吸棄上清，以培養基重懸沉淀的巨噬細胞，接種于6孔培養板，置于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育48 h，應用全自動酶標儀于492 nm波長下檢測總膽固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C) 和高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的含量。

1.2.6 AI值的計算：按下述公式計算AI：AI=non-HDL-C/HDL-C，其中non-HDL-C=TC-HDL-C。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況 模型組大鼠均成功建立ACS模型，心電圖見圖1。造模后模型組大鼠生命體征均表現穩定，兩組大鼠均精神狀態良好，毛發光亮，體重穩定，飲食飲水正常，實驗期間均未發生死亡。

2.2 兩組大鼠心肌和主動脈組織形態學 HE染色可見模型組大鼠心肌纖維和間質壞死，心肌細胞核呈碎裂或變性狀改變，大量炎性細胞浸潤，間質水腫；主動脈壁內有大量脂質和鈣鹽沉積，內膜明顯增厚，可見大量泡沫細胞，平滑肌細胞排列紊亂。對照組大鼠心肌組織形態基本正常，可見極少量炎性細胞浸潤，心肌細胞胞漿染色均勻；主動脈壁內膜無增厚，未見脂質沉積和泡沫細胞。見圖2。

A：對照組心臟；B：模型組心臟；C：對照組主動脈；D：模型組主動脈

2.3 兩組大鼠心肌梗死面積比例和易損指數比較 模型組大鼠心肌梗死面積比例和易損指數均顯著高于對照組，兩組比較差異具有統計學意義(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠心肌梗死面積比例和易損指數比較

2.4 兩組大鼠外周血巨噬細胞中脂質表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠外周血巨噬細胞中TC、TG和LDL-C表達水平均較高，而HDL-C表達水平較低，差異具有統計學意義(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠外周血巨噬細胞中脂質表達水平比較(mmol/L)

2.5 各組大鼠non-HDL-C和AI值比較 與對照組比較，模型組大鼠的non-HDL-C和AI值均較高(均P<0.05)，差異具有統計學意義，見表3。

表3 各組大鼠non-HDL-C和AI值比較

2.6 相關性分析 Pearson相關性分析顯示，ACS大鼠AI值與外周血巨噬細胞中TC(r=0.627，P<0.001)、TG(r=0.438，P<0.001)和LDL-C(r=0.699，P<0.001)呈正相關，與HDL-C(r=-0.521，P<0.001)呈負相關，見表4。

表4 相關性分析

2.7 多元線性回歸分析 將上述各指標作為自變量、AI值為因變量納入多元線性回歸分析，結果表明，TC(β=0.616，P<0.001)、TG(β=0.215，P<0.001)、LDL-C(β=0.757，P<0.001)和HDL-C(β=-0.255，P<0.001)是AI值的獨立影響因素，見表5。

表5 多元線性回歸分析

3 討 論

ACS的病理機制主要為動脈粥樣硬化易損斑塊的破裂、血栓的形成以及血管痙攣，具有極高的致殘率和致死率，是嚴重威脅患者生命健康的心血管急危重癥[6]，因此及早診斷和干預對于ACS的預防和治療具有至關重要的意義。

本研究采用頭部和四肢多點皮下注射鹽酸異丙腎上腺素的方法建立了ACS大鼠模型，并以心電圖檢查確認造模成功。HE染色可見，與對照組大鼠相比，模型組大鼠出現心肌纖維和間質壞死，心肌細胞核呈碎裂或變性狀改變，大量炎性細胞浸潤，間質水腫；主動脈壁內有大量脂質和鈣鹽沉積，內膜明顯增厚，可見大量泡沫細胞，平滑肌細胞排列紊亂，提示模型組大鼠出現了較為嚴重的動脈粥樣硬化癥狀。通過計算大鼠心肌梗死面積比例發現，模型組顯著高于對照組，同樣提示ACS造模成功。易損斑塊的穩定性是影響ACS發生發展的重要決定性因素[7-8]，易損斑塊的破裂所導致的血栓是ACS發生的病理學基礎，易損指數是綜合評價動脈粥樣硬化斑塊穩定性的參數之一，該參數將泡沫細胞和細胞外脂質等脂質成分與平滑肌細胞和膠原纖維等纖維肌性成分相結合，可更為客觀、全面的衡量斑塊的穩定性[9-11]，本研究中模型組大鼠的易損指數顯著高于對照組，提示ACS模型大鼠斑塊較為不穩定，可能存在較多的易損斑塊。上述結果均提示模型組大鼠出現了典型的ACS癥狀。

巨噬細胞脂質穩態是指巨噬細胞內脂質含量的動態平衡，當該平衡受外界因素影響或細胞因子的調控而被打破時，尤其是當胞內脂質含量增多時，胞內脂質累積即可引發巨噬細胞泡沫化，而后者為影響ACS發生發展的重要因素之一[12-14]。動物實驗發現，高膽固醇飼料喂養的大鼠更易誘發動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)或ACS模型，說明脂質攝取和代謝的穩態在此類疾病的發生發展中發揮了重要作用[15]。另有研究[16]證實，TC和LDL-C的增加，以及HDL-C的減少，導致LDL-C/HDL-C比值的升高，是ACS最基本的致病原因之一。LDL-C一方面可慢性炎癥損傷血管內皮功能，和單核細胞進入內皮下被氧化修飾為ox-LDL和巨噬細胞；另一方面，LDL-C可和各類炎癥因子、單核細胞等聚集于內皮表面，產生黏附分子和多種細胞因子，進一步加重對內皮功能的損傷，形成惡性循環，從而導致ACS及AS等疾病的發生。隨著研究的不斷深入，發現冠脈病變與LDL-C的關聯并非線性的，極低密度脂蛋白膽固醇(Very low density lipoprotein cholesterol,VLDL-C)在TG≥200 mg/dl時被降解而間接引起LDL-C的升高，被巨噬細胞吞噬而導致巨噬細胞泡沫化，從而促進AS的進程。AI為TC與HDL-C含量的差值除以HDL-C，包含了所有與動脈硬化相關的脂質成分，可反映脂質中危險成分與保護成分的比值，是衡量動脈粥樣硬化程度的重要指標[17]。LDL-C已在既往研究[17]中被證實與冠狀動脈心臟病的發生密切相關，是冠狀動脈病理性改變的重要危險因素之一。然而近年來的研究[18]認為，AI可作為LDL-C小而密的替代性參數，可能成為臨床診斷ACS的新型指標之一。

本研究中，模型組大鼠外周血巨噬細胞中TC、TG和LDL-C的表達水平均顯著高于對照組，而HDL-C的表達水平顯著低于對照組，提示巨噬細胞中脂質的表達動態平衡可能與ACS的發生發展有關；同時，模型組大鼠的non-HDL-C和AI值均顯著高于對照組，提示巨噬細胞中脂質的表達水平可能與AI值存在一定關聯。進一步的Pearson相關性分析表明，ACS大鼠的AI值與外周血巨噬細胞中TC(r=0.627，P<0.001)、TG(r=0.438，P<0.001)和LDL-C(r=0.699，P<0.001)呈正相關，與HDL-C(r=-0.521，P<0.001)呈負相關；多元線性回歸分析結果顯示，TC(β=0.616，P<0.001)、TG(β=0.215，P<0.001)、LDL-C(β=0.757，P<0.001)和HDL-C(β=-0.255，P<0.001)是AI值的獨立影響因素，進一步揭示了ACS大鼠外周血巨噬細胞中脂質的穩態與AI值密切相關。張海波等[19]的研究同樣表明，脂代謝異常與ACS的發生發展密切相關，血栓的形成與TC/HDL-C比值的升高關系密切，ACS患者TC顯著升高、HDL-C顯著降低，同時AI值顯著升高，AI與ACS具有明顯的相關性，可作為ACS的獨立危險因素之一。金雷等[20]的研究亦證實，冠狀動脈心臟病患者的non-HDL-C與AI值呈正相關，將AI與常規生化指標聯合應用，可更好的評估冠脈病變情況，為冠狀動脈心臟病的及早診治提供一定的支持。

綜上所述，本研究表明，ACS模型大鼠外周血巨噬細胞中脂質穩態與AI密切相關，TC、TG、LDL-C和HDL-C是AI值的獨立影響因素。然而，本研究僅揭示了ACS模型大鼠外周血巨噬細胞中脂質的穩態與AI值的關聯，其與ACS發生發展的具體作用機制的關系仍有待進一步深入探究。