TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p在胃癌組織中的表達及與疾病演進的相關性

張科 成翠娥 陸志平 肖龍 王斌

胃癌(gastric cancer，GC)是世界范圍內最常見的消化道惡性腫瘤之一，且在惡性腫瘤中其致死率排名第二[1]。隨著近年來基礎及臨床研究的不斷進步，在診治GC方面亦取得了很大進步[2]。相關報道稱，TGM2與多種腫瘤的發生及發展有密切聯系[3]。許多研究發現，NEAT1在惡性腫瘤中表達異常，如神經膠質瘤[4]、乳腺癌[5]等，其在腫瘤的發生、轉移及預后都有參與。miRNA為小分子非編碼RNA，可調控大約30%的人類基因表達，有相關報道發現，miRNA-17-5p在腫瘤的發生、發展中有重要作用[6]。但筆者發現關于TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p在GC組織中的表達及與疾病演進的相關性尚不明確。鑒于此，本文通過檢測GC組織、正常胃黏膜組織中TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p表達水平，分析其與疾病演進的相關性。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本文選取2018年12月至2020年11月我院病理科保存的GC組織標本74例為研究組，其中包括男42例，女32例；年齡43～78歲，病程1～4年。另選取同一時間段在我院病理科保存的正常胃黏膜(距離癌組織>5 cm)74例為對照組，男45例，女29例；年齡44～80歲，病程0.5～4年。2組研究對象一般資料的比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組患者一般資料比較 n=74

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：研究組符合中國專家共識意見中關于早期GC的篩查標準[7]；均經組織病理檢查確診原發性GC的患者；研究組患者均為初診，且診斷之前未接受有關腫瘤的治療；近期未服用如H2受體拮抗劑、抗生素等影響研究結果藥物的患者；本文研究對象及其家屬均知情，簽署知情同意書，經過我院倫理委員會批準。

1.2.2 排除標準：伴隨其他腸道疾病的患者；60 d內有胃或十二指腸手術史的患者；伴隨肝腎功能異常的患者；伴隨嚴重心腦血管疾病、精神疾病、風濕性疾病的患者；伴隨肝、腎、肺等嚴重臟器疾病的患者；伴隨全身免疫性疾病的患者。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化:使用EnVision法檢測GC組織、正常胃黏膜組織中TGM2、NEAT1的表達水平：①多聚甲醛(雷根生物科技有限公司)固定GC組織、正常胃黏膜組織，常規石蠟切片后進行烤片，使用二苯甲、乙醇進行脫蠟至水，PBS清洗3次，3 min/次。②于微波盒中加入檸檬酸鹽緩沖液，加熱至沸騰后將GC組織切片置與耐熱塑料切片架上，PBS清洗3次，3 min/次。③0.3% H2O2加入切片15 min，阻斷內源性過氧化物酶，PBS清洗3次，5 min/次。④加入50 μl鼠抗人CK，37℃作用60 min，50 μl鼠抗人C-erbB-2，37℃作用60 min，PBS清洗3次，5 min/次。于鼠抗人CK、鼠抗人C-erbB-2加入HRPanti-Mouse或Pabbit，37℃作用30 min，PBS清洗3次，5 min/次。⑤加入DAB顯色，于顯微鏡下觀察，純凈水沖洗6 min，蘇木素復染，對其進行分化、沖洗、藍化，梯度乙醇脫水，隨后進行風干。⑥使用對應的免疫組化試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司)檢測TGM2、NEAT1的表達水平。

1.3.2 miRNA-17-5p的檢測:采用熒光定量PCR檢測miRNA-17-5p表達水平，用Trizol的方法，提取所收集的細胞內總RNA，在逆轉錄酶的作用下合成cDNA。使用熒光定量PCR儀(濟南來寶醫療器械有限公司)檢測、miRNA-17-5p基因及內參GAPDH mRNA表達，檢測試驗共重復3次，采用軟件Relative Quantification Study定量分析。

1.3.3 病理學觀察:①將采集到的標本經乙醇梯度脫蠟至水，隨后放入Harris蘇木素染4～10 min，用純凈水清洗。②迅速用1%的鹽酸乙醇進行分色，置于純凈水10～20 min。③放入伊紅染液中染色3 min。④常規脫水后封片，于顯微鏡下進行觀察。

1.3.4 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p陽性判定方法:采用半定量法(染色陽性細胞比例與染色強度等級之乘積)：在顯微鏡下隨機選取10個高倍視野(×400)的切片，選取的每張切片細胞數量≥100個，0級為陽性細胞<10，1級為10%～25%，2級為26%～50%，3級為51%～75%，4級為76%～100%；根據染色程度：0級為無色，1級為淡黃色，2級為棕黃色，3級為棕褐色，按照等級乘積，陽性為≥6。

1.3.5 PGⅠ、PGⅡ的檢測:抽取患者次日清晨空腹靜脈血4 ml，置于轉速為3 000 r/min離心機中進行10 min的離心處理。分離上血清，并將血清標本置于-80℃的環境中進行保存。采用酶聯免疫吸附法檢測PGⅠ、PGⅡ水平[8]。

2 結果

2.1 TGM2、NEAT1免疫組化染色 與對照組比較，研究組TGM2、NEAT1的免疫組化染色程度高，著色更深，且著色表達多呈灶狀分布。見圖1。

2.2 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p陽性表達比較 與對照組比較，研究組TGM2、NEAT1陽性表達率較高，miRNA-17-5p陽性表達率較低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p陽性表達比較 n=74,例(%)

2.3 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p陽性表達與GC患者的病理學參數比較 在分化程度、腫瘤大小、細胞學分型中TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p陽性表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與無淋巴轉移比較，有淋巴轉移患者TGM2、NEAT1陽性表達率較高，miRNA-17-5p陽性表達率較低；與臨床Ⅲ～Ⅳ期比較，Ⅰ～Ⅱ期患者TGM2、NEAT1陽性表達率較高，miRNA-17-5p陽性表達率較低；與黏膜下層比較，TGM2、NEAT1陽性表達率較高，miRNA-17-5p陽性表達率較低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p陽性表達與GC患者的病理學參數比較 n=74,例(%)

2.4 GC組織的Logistic回歸分析 以發生GC為因變量(0=否，1=是)，TGM2、NEAT1、miRNA-17-5pR、PGⅠ、PGⅡ為自變量，建立Logistic回歸模型，并校正年齡、性別等混雜因素影響，最終TGM2、NEAT1、miRNA-17-5pR、PGⅠ、PGⅡ是發生GC的危險因素。見表4。

2.5 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5pR表達水平對發生GC的預測價值 ROC分析TGM2、NEAT1、miRNA-17-5pR表達水平預測發生GC的曲線下面積(area under the curve，AUC)分別為0.662(95%CI：0.575～0.748，P=0.000)、0.716(95%CI：0.635～0.797，P=0.000)、0.754(95%CI：0.677～0.829，P=0.000)。見表5，圖2。

表4 患者發生GC的Logistic回歸分析

表5 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p表達水平診斷發生GC的效能分析 %

圖2 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p表達水平診斷發生GC的ROC圖

3 討論

近年來雖然在治療GC方面有所進展，但是其死亡率仍然居高不下。有相關調查顯示，在全世界范圍內，GC的發病率在10～150萬，在我國，其每年確診人數在40萬左右，每年死亡26萬左右，其中重要的原因在于早期并沒有明顯的診斷手段[9,10]。因GC在早期癥狀大多比較隱秘，且并沒有典型的癥狀，因此，在早期很難確診GC，而當患者就診時，大多處于癌癥晚期，在體內已經有局部浸潤和遠處轉移的出現，這時已經錯過最佳的治療時機[11,12]。本研究通過多因素Logistic回歸分析，TGM2、NEAT1、miRNA-17-5pR表達水平均與發生GC獨立相關，提示TGM2、NEAT1、miRNA-17-5pR表達水平可以作為臨床預測GC的指標。

TGM2是轉谷胺酶家族成員之一，由687個氨基酸殘基組成，其分子量為78 kD。越來越多的研究表明，TGM2表達與多種惡性腫瘤細胞增殖及遷移密切相關，其在不同的細胞中具有不同的生物學功能[13]。相關文章報道，TGM2表達后可通過激活FAK酪胺肌酸酶活化抗凋亡信號通路PI3/AKT等，達到促進腫瘤細胞增殖的作用[14]。更有學者發現，TGM2可通過激活NF-kB通路誘導Bcl-xL與BFLI抗凋亡蛋白的表達，促使腫瘤細胞增殖[15]。周湘華等[16]的研究中表明，GC細胞中TGM2表達降低時細胞增殖能力也隨之降低，在細胞增殖中TGM2可能存在促進作用。其機制可能為：TGM2高表達后，細胞生長加速，其依賴性生長能力增加、克隆數目增多，通過影響細胞的凋亡和周期促進細胞生長增殖。本文研究中，GC組織中TGM2陽性表達率高表達，與淋巴轉移、臨床分期、病灶深度顯著相關，提示TGM2表達異常可能參與GC患者發病的過程。Logistic回歸分析示TGM2表達水平增高增加1.138倍發生GC風險，ROC分析顯示TGM2預測發生GC的AUC達0.662，靈敏度和特異度分別為75.52%、80.36%，提示TGM2可用于評估GC的發生。

NEAT1位于細胞核內，參與構成核旁斑的核心結構及調節眾多基因轉錄。NEAT1是一種多聚腺苷酸化、未拼接及受限制的非編碼轉錄本，其為RNA聚合酶2轉錄而來，被稱為多發性內分泌瘤病。與正常組織比較，NEAT1在一些腫瘤組織及細胞系中表達升高，表明NEAT1高表達預后較差。相關研究表明，在卵巢癌組織中NEAT1呈高表達，是診斷卵巢癌的標志物，且其表達水平隨著卵巢癌組織的大小以及腫瘤的分期的增加而升高[17]。喻大軍等[18]研究中顯示，GC中NEAT1表達水平升高，且在沉默NEAT1后，GC細胞的增殖和侵襲的能力降低。有相關研究表明，NEAT1可抑制GC細胞增殖與克隆形成，其機制可能與下調p-Akt、bcl-2極上調bax有關[19]。本文研究表明，在GC組織中NEAT1陽性表達率高表達，淋巴轉移、臨床分期、病灶深度與其有明顯的相關性，說明NEAT1與GC的發生及發展密切相關。本研究ROC分析顯示NEAT1預測發生GC的AUC達0.716，提示NEAT1是GC的警示指標。

miRNA在生物體內廣泛存在，在腫瘤的發生發展、細胞的分化、增殖及凋亡中發揮著重要作用。miRNA-17-5p屬于miR-17家族，在血液系統惡性腫瘤、生物體發育及實體瘤的發生中具有重要作用。相關報道稱，miRNA-17-5p參與前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌、GC等的發生[20]，可誘導周期阻滯及抑制腫瘤細胞增殖、侵襲轉移。在GC中，miRNA-17-5p可通過抑制細胞凋亡、促進細胞周期進程達到發揮癌基因的作用[21]。當miRNA-17-5P>6.2 μmol/L時預測GC的靈敏度80.60%，特異度74.63%。本文研究顯示，在GC組織中miRNA-17-5p呈低表達，與GC患者的淋巴轉移、臨床分期、病灶深度緊密相關，說明miRNA-17-5p有望成為GC的預后、病情及早期診斷標志物。

綜上所述，GC患者組織在淋巴轉移、Ⅰ～Ⅱ期、黏膜層TGM2、NEAT1陽性表達較高，miRNA-17-5p陽性表達較低，提示TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p陽性表達與GC的病情嚴重程度密切相關，可能參與GC患者病情發生及發展過程，為研究GC發病機制及患者預后提供參考。