Siglec-9對TNF-α誘導的關節軟骨細胞TLR4/NF-κB通路及凋亡的影響

王曉元 沈海麗 王鑫 張莉 朱蓉 熊詠民

骨關節炎是一種常見的慢性退行性關節疾病，與軟骨及其周圍組織有關，臨床表現為進行性關節疼痛、僵硬及功能障礙等，長期易導致嚴重的殘疾，給患者生活帶來極大不便，嚴重影響患者身心健康[1]。軟骨細胞是關節軟骨內的唯一細胞，參與細胞外基質降解、合成過程，其異常會導致外基質穩態失衡，最終導致關節功能喪失[2]。Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)是天然免疫受體，與相應配體作用后，通過激活核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通路調控白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8等多種炎性因子的產生與釋放[3]。研究表明，TLR4/NF-κB通路在軟骨細胞炎癥損傷過程中發揮重要作用[4]。唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素9(sialic acid-binding Ig-like lectin 9，Siglec-9)能夠調節多種免疫細胞的功能，是炎癥相關疾病的重要調控分子，能夠通過抑制NF-κB途徑減輕腸道炎癥[5,6]。但Siglec-9對關節軟骨細胞炎癥損傷的作用目前尚無相關研究。本研究將通過使用腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)誘導關節軟骨細胞發生炎癥損傷，研究Siglec-9對該過程的影響并探索涉及到的相關機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人關節軟骨細胞(貨號：CP-H096)購自武漢益普生物科技有限公司；DMEM-F12培養基(貨號：DXT-C11330500BT)購自美國invitrogen公司；胎牛血清(貨號：FBS500-S)購自澳大利亞AusGeneX公司；TNF-α(貨號：CYT-252)購自以色列prospec公司；Siglec-9(貨號：ATMP01933HU)購自武漢益普生物科技有限公司；MTT溶液(貨號：N/A-896)購自美國AMEKO公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：S0185)購自哈爾濱新海基因檢測有限公司；人IL-1β、IL-6和IL-8酶聯免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號：YJ401158、YJ401120、YJ1012241)購自上海一基實業有限公司；TLR4抗體、NF-κB p65抗體、p-NF-κB p65抗體、核因子κB抑制蛋白α(nuclear factor kappa B inhibitor protein alpha，IκB-α)抗體、p-IκB-α抗體、GAPDH抗體(貨號：ab13556、ab140751、ab194726、ab95338、ab92700、ab181602)購自abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(貨號：0295G-HRP)購自美國santa公司；恒溫培養箱(型號：TY10GI2-2)購自美國Shellab公司；酶標儀(型號：Stat Fax-2100)購自美國Awareness公司；流式細胞儀(型號：BD FACSCanto II)購自美國BD公司；化學發光成像系統(型號：MG8000)購自美國Thmorgan公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養:將人關節軟骨細胞接種于含5%胎牛血清的DMEM-F12培養基中，置于5℃、5% CO2培養箱中進行培養、傳代。

1.2.2 MTT法檢測軟骨細胞活性:用DMEM-F12培養基將軟骨細胞配制成1×105個/ml的單細胞懸液，以每孔100 μl接種于96孔板，分為對照組、TNF-α組、低濃度Siglec-9組、中濃度Siglec-9組和高濃度Siglec-9組。對照組不添加藥物處理，TNF-α組添加終濃度為20 ng/ml的TNF-α，低、中、高濃度Siglec-9組添加終濃度為20 ng/ml的TNF-α及終濃度分別為2、10和50 ng/ml的Siglec-9。孵育48 h，棄上清，每孔加MTT溶液100 μl，繼續孵育4 h，每孔加DMSO 150 μl， 震蕩10 min充分溶解結晶，使用酶標儀于波長570 nm處檢測各孔吸光度(optical density，OD)值，計算細胞存活率(%)。細胞存活率=OD給藥組/OD對照組×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測軟骨細胞凋亡情況:用DMEM-F12培養基將軟骨細胞配制成1×105個/ml的單細胞懸液，以每孔100 μl接種于96孔板，按照1.2.2步驟進行分組處理，培養48 h，收集細胞，使用1×結合緩沖液將細胞濃度調整為1×106個/ml，取100 μl細胞懸液于離心管中，加入Annexin V-FITC 5 μl、PI 5 μl 混勻，避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 ELISA法檢測軟骨細胞上清液中炎性因子水平:用DMEM-F12培養基將軟骨細胞配制成1×105個/ml的單細胞懸液，以每孔100 μl接種于96孔板，按照1.2.2進行分組處理，培養48 h，離心收集上清液，分別按照IL-1β、IL-6和IL-8 ELISA試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀檢測450 nm波長處的各孔OD值，計算IL-1β、IL-6和IL-8水平。

1.2.5 蛋白印跡(western blot，WB)法檢測軟骨細胞中TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達情況:用DMEM-F12培養基將軟骨細胞配制成1×105個/ml的單細胞懸液，以每孔200 μl接種于6孔板，按照1.2.2部分進行分組處理，培養48 h，收集細胞，用蛋白裂解液裂解，離心取上清，BCA法定量，SDS-PAGE電泳分離蛋白質，并轉至PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入TLR4抗體(1∶1 000)、p-NF-κB p65抗體(1∶500)、NF-κB p65抗體(1∶500)、p-IκB-α抗體(1∶200)、IκB-α抗體(1∶200)、GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加羊抗兔二抗(使用辣根過氧化物酶標記，1∶2 000)，室溫孵育30 min，化學發光法顯色，使用凝膠成像儀曝光拍照，分析條帶灰度，計算相對表達量。

2 結果

2.1 5組軟骨細胞活性 與對照組相比，TNF-α組軟骨細胞存活率顯著降低(P<0.05)；與TNF-α組相比，低、中、高濃度Siglec-9組軟骨細胞存活率顯著升高(P<0.05)；隨著Siglec-9處理濃度的升高，軟骨細胞存活率顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2 5組軟骨細胞凋亡情況 與對照組相比，TNF-α組軟骨細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與TNF-α組相比，低、中、高濃度Siglec-9組軟骨細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；隨著Siglec-9處理濃度的升高，軟骨細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖1，表2。

表1 5組軟骨細胞存活率比較

對照組TNF-α組低濃度Siglec-9組中濃度Siglec-9組高濃度Siglec-9組

表2 5組軟骨細胞凋亡率比較

2.3 5組軟骨細胞上清液中炎性因子水平 與對照組相比，TNF-α組軟骨細胞上清液中IL-1β、IL-6和IL-8水平顯著升高(P<0.05)；與TNF-α組相比，低、中、高濃度Siglec-9組軟骨細胞上清液中IL-1β、IL-6和IL-8水平顯著降低(P<0.05)；隨著Siglec-9處理濃度的升高，軟骨細胞上清液中IL-1β、IL-6和IL-8水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 5組軟骨細胞上清液中IL-1β、IL-6和IL-8水平比較

2.4 5組軟骨細胞中TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達情況 與對照組相比，TNF-α組軟骨細胞中TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκB-α/IκB-α蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與TNF-α組相比，低、中、高濃度Siglec-9組軟骨細胞中TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκB-α/IκB-α蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；隨著Siglec-9處理濃度的升高，軟骨細胞中TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκB-α/IκB-α蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表4。

表4 5組軟骨細胞中TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達水平比較

3 討論

軟骨退變是骨關節炎的主要病理變化之一，而軟骨細胞是軟骨內唯一的細胞，在維持軟骨完整性及軟骨負重功能方面發揮重要作用[7]。在骨關節炎發病過程中，炎性因子可促使關節軟骨細胞凋亡，周圍組織纖維化[8]。因此，通過有效抑制炎性反應對軟骨細胞的凋亡作用，或成為治療骨關節炎的有效途徑。

TNF-α是骨關節炎進程的關鍵炎性細胞因子[9]，本研究使用TNF-α誘導軟骨細胞，結果顯示，軟骨細胞的存活率降低，凋亡率升高，同時細胞上清液中炎性因子IL-1β、IL-6和IL-8水平升高，可用于模擬骨關節炎中軟骨細胞生存環境。Siglecs是一類經典的免疫球蛋白樣凝集素，能夠介導細胞與病原體之間，或細胞與細胞之間的相互作用，在免疫中發揮重要調控作用，廣泛參與炎癥性疾病、機體自身免疫性疾病及腫瘤等疾病的發生發展過程[10]。Siglec-9是主要表達于單核細胞、中性粒細胞表面的Siglecs家族成員，在小鼠上又被稱為Siglec-E。有研究表明，在大鼠脊髓損傷模型中，Siglec-9能夠抑制巨噬細胞由促炎型M1細胞向抗炎型M2細胞極化，從而抑制炎性反應強度[11]。而Kano等[12]稱，Siglec-9能夠誘導M2巨噬細胞的局部浸潤，發揮抗炎和促進組織修復作用。近年來，Matsumoto等[13]研究發現，可溶性Siglec-9在膠原誘導的小鼠關節炎模型中發揮抑制作用，可顯著抑制關節炎發生率，降低關節炎小鼠臨床和組織學病變程度，同時降低血清促炎因子TNF-α濃度。本研究使用低、中、高濃度Siglec-9作用于TNF-α誘導的軟骨細胞，結果顯示，軟骨細胞凋亡率及細胞上清液中炎性因子IL-1β、IL-6和IL-8水平較TNF-α組顯著降低，細胞存活率顯著升高，且變化隨Siglec-9濃度的升高而加劇，提示Siglec-9可影響炎性反應程度，減輕軟骨細胞炎癥損傷，促進細胞增殖并抑制細胞凋亡。

TLR4/NF-κB信號通路是常見的炎癥通路之一。TLR4屬于跨膜受體，能夠識別病原相關分子模式及受體復合物，激活信號轉導途徑，誘發炎性因子表達，引發炎性反應[14]。NF-κB處于TLR4信號通路下游，未受到刺激時以非活化形式與IκB-α結合形成復合物，當促炎因子刺激細胞后，IκB-α發生磷酸化、泛素化繼而水解，NF-κB釋放并活化調控下游通路，激活炎癥級聯反應，誘導細胞凋亡[15]。范忠誠等[16]研究表明，水通道蛋白4基因表達可通過抑制NF-κB信號通路促進兔軟骨細胞活力、抑制凋亡，對TNF-α誘導的軟骨細胞損傷起保護作用。Ding等[17]研究表明，MicroRNA-93通過靶向TLR4/NF-κB信號通路，對骨關節炎中軟骨細胞凋亡和炎性反應起抑制作用。本研究結果顯示，TNF-α誘導軟骨細胞后，細胞中TLR4、NF-κB p65磷酸化、IκB-α磷酸化蛋白水平均顯著升高，提示TLR4/NF-κB通路參與TNF-α誘導軟骨細胞產生的炎性反應。使用低、中、高濃度Siglec-9處理后，細胞中TLR4、NF-κB p65磷酸化、IκB-α磷酸化蛋白水平較TNF-α組顯著降低，提示Siglec-9可能通過阻斷TLR4/NF-κB通路降低炎性因子水平，減輕TNF-α誘導軟骨細胞產生的炎性反應，減少細胞凋亡，提高細胞存活率。

綜上所述，Siglec-9對TNF-α誘導的關節軟骨細胞凋亡及TLR4/NF-κB通路激活具有抑制作用，并可提高細胞存活率，可能為骨關節炎治療提供新的潛力藥物，后期將尋找更多的角度探究Siglec-9對骨關節炎的治療作用及機制。