一株HIV-1 CRF65-cpx新型重組毒株的檢出及基因重組序列分析▲

張培東 梁華悅 黃泫茜 謝海 莫實德 勞飛翔 梁冰玉*

1 防城港市疾病預防控制中心，廣西防城港市 538021；2 廣西醫科大學公共衛生學院&廣西艾滋病防治研究重點實驗室，南寧市 530021

近年來，全球獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)流行情況越發嚴峻。多種HIV毒株在同一地區流行時，HIV復制過程中發生的突變以及病毒之間的基因重組都會增加HIV-1基因型的遺傳多樣性和復雜性。重組病毒在至少3例及以上無流行病學關聯的個體流行，即可鑒定為一種新流行重組型(circulating recombinant form, CRF) HIV毒株[1]。現在，全球已有118 種流行重組亞型(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/CRFs.html)。2015年全國第四次HIV分子流行病學調查發現，4種優勢HIV-1 CRF占所有HIV毒株的89.3%，分別是CRF07-BC(41.3%)，CRF01-AE(32.7%)，CRF08-BC(11.3%)和B亞型(4.0%)[2]。廣西主要流行的優勢HIV 毒株是CRF01-AE，其次是CRF07-BC和CRF08-BC，且有多種新型的重組毒株流行，例如CRF-59-01B、CRF55-01B[3-5]。在多種毒株共同流行的背景下，近年來廣西陸續出現許多新的CRF和獨特重組型(unique recombinant form, URF)，包括CRF01-AE/CRF08-BC、CRF01-AE/CRF07-BC、CRF01-AE/CRF07-BC/CRF08-BC[6-9]，但尚無含 3種或3種以上基因亞型的新型CRF的研究報道。本研究檢測分析發現一種新的CRF65-cpx重組體(B/C/CRF01-AE)，是廣西地區首次發現的復雜重組毒株，通過對其每個重組片段進行序列和進化分析，探討其重組形式的產生與境外、境內毒株的關聯，以及此重組型在廣西地區是否有散發流行的可能性，可為開展HIV防治工作提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究病例為男性患者，來自中國(廣西)越南邊境某市，45歲，因異性性行為感染HIV，患者血清樣本編號為BFC92。

1.2 HIV-1 RNA提取 采用RNA病毒提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit (德國QIAGEN)、離心柱吸附法提取血清樣本HIV-1 RNA，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.3 HIV-1基因擴增、純化和測序 分兩輪擴增病毒RNA。第一輪采用 SuperScript Ⅲ First-stand Synthetic System transcriptase試劑盒(美國Invitrogen)將HIV-1 RNA反轉錄為cDNA，反應體系為25 μL。第二輪以cDNA為模板，采用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity 試劑盒(美國Invitrogen)進行巢式PCR擴增，反應體系為50 μL。擴增反應條件如下：94 ℃預熱2 min；94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、68 ℃ 4 min，進行35個循環，終延伸68 ℃ 10 min，8 ℃保存。兩輪PCR擴增后所得PCR產物為近似全長基因組。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切割PCR產物條帶回收，其純化和測序委托北京天一輝遠生物科技有限公司進行。PCR擴增引物及測序引物參照文獻[10]。

1.4 近似全長基因系統進化樹分析 采用 Los Alamos HIV Sequence Database 的在線工具HIV Align對序列進行剪切校正，再用 BioEdit 軟件進行手工校對。從Los Alamos HIV Sequence Database(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html)中下載HIV-1各亞型參考序列，采用 MEGA-X軟件、neighbour-joining法、Kimura two-parameter模型構建近似全長基因系統進化樹， Bootstrap Replications設置為1 000次，當分支節點自展值(Bootstrap值)大于0.7時，認為該節點置信度較高。

1.5 重組序列斷點分析 將得到的近似全長基因序列提交到在線分析軟件HIV-1 Sequence Quality Analysis(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/QC/index.html)，以 HXB2 為標準參考株，排除序列組裝錯誤后，采用Los Alamos HIV Sequence Database 的在線工具jpHMM模型(jumping profile Hidden Markov Model)(http://jphmm.gobics.de/)進行重組序列斷點分析，并利用Los Alamos HIV Database在線工具Recombinant HIV-1 Drawing Tool(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/DRAW_CRF/recom_mapper.html)生成基因序列圖；進一步采用MEGA-X軟件構建(修飾)亞基因組系統進化樹。

1.6 耐藥分析 將比對整齊的fasta序列文件上傳至斯坦福大學耐藥數據庫(https://hivdb.stanford.edu/hivdb/by-sequences/)，利用HIV dbProgram模塊按照第9.0版本的基因型抗性解釋算法篩選出序列中存在的耐藥突變位點。

2 結 果

2.1 近似全長基因系統進化樹和耐藥分析 測序結果顯示，序列全長為8900 bp，是以C為骨架，插入CRF01-AE和B亞型片段的流行重組毒株。將本研究獲得序列與國內報道的5條CRF65-cpx參考序列[11-12]進行聚類，結果顯示6條序列可聚合構成為一個單系聚類，Bootstrap值為95%，提示該毒株是由 CRF01-AE、B及C組成的CRF65-cpx重組亞型(B/C/CRF01-AE)毒株。見圖1。耐藥分析結果顯示，該毒株存在V179D突變，耐藥評分10分，對EFV、ETR、NVP、RPV藥物敏感。

圖1 樣本BFC92毒株的近似全長基因系統進化樹

2.2 重組序列斷點分析 重組序列斷點分析結果顯示，該序列由14個片段重組而成(見圖2A)。參照HIV-1標準毒株HXB2，該毒株的序列位置為790～9412bp，從5′至3′端涵蓋了病毒所有的調節基因和結構基因，分別為gag、pol、vif、vpr、tat、vpu、env、rev和nef，是較為完整的基因序列，見圖2B。

圖2 樣本BFC92毒株的重組序列斷點分析

2.3 分段基因序列進化樹分析 樣本BFC92毒株近全長基因序列由 CRF01-AE、CRF01-B 和 CRF01-C 組成，序列位置為790～9412bp，含14個片段，其13個斷點位置為1170、3803、4015、5655、5830、5993、6378、7586、8349、8506、8568、8830和8995，片段Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和Ⅻ為CRF01-AE亞型，片段Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ和ⅩⅢ為B亞型，片段Ⅱ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅺ和ⅪⅤ為C亞型。對14個重組片段分別構建亞區域基因進化樹(見圖3)，分析斷點位置的置信度，片段Ⅰ(所在區段HXB2：790-1169bp)、Ⅴ(5655-5829)、Ⅶ(5993-6377)、Ⅹ(8349-8505)和Ⅻ(8568-8829)與 CRF01_AE 聚集成簇，其Boostrap 值分別為99%、94%、99%、80%和100%。片段Ⅲ(3803-4014)、Ⅵ(5830-5992)、Ⅸ(7585-8348)和ⅩⅢ(8830-8994)與B聚集，Boostrap 值分別為83%、84%、70%和89%。片段Ⅱ(1170-3802)、Ⅳ(4015-5654)、Ⅷ(6378-7585)、Ⅺ(8506-8567)和ⅪⅤ(8995-9412)與C聚集，Boostrap 值分別為100%、99%、98%、82%和99%。

圖3 樣本BFC92毒株近似全長基因序列14段片段的亞型分析進化樹

3 討 論

HIV-1重組株是重復感染或合并感染多種亞型形成的[1]。2013年，CRF65-cpx毒株在中國云南異性性傳播人群中被檢出，這是在中國發現的一種流行HIV重組亞型[11]。既往研究結果顯示，CRF65-cpx毒株大約在2000年(1997～2003年)起源于云南省，并于2007年(2005～2008年)傳入北京市和安徽省的同性戀人群[13-14]。研究結果表明，CRF65-cpx重組毒株主要在同性戀人群中流行傳播，而在云南主要是在異性人群中傳播[15-16]。本研究結果顯示，在廣西異性接觸感染HIV-1的患者中鑒定出CRF65-cpx重組體(B/C/CRF01-AE)。

本研究中的HIV-1感染患者具有云南服役史，因異性性傳播而感染，推測該患者是在云南服役期間感染此毒株。廣西與云南相鄰，CRF65-cpx毒株很容易從云南傳入廣西。本研究結果顯示，重組毒株(B/C/ CRF01-AE)的B亞型基因片段(Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ和ⅩⅢ)與泰國B亞型毒株存在聚類，CRF01-AE亞型插入片段(Ⅰ、Ⅴ、Ⅹ和Ⅻ)與越南北部IDU流行的CRF01-AE毒株聚類[17-18]；該重組毒株(B/C/CRF01-AE)與在云南異性人群中首次發現的CRF65-cpx毒株具有很高的同源性。

既往研究結果顯示，CRF01-AE和B亞型耐藥相關位點的突變頻率較高，毒株中V179D/E突變發生頻率為11.06%(6.24%～17.00%)，偶見于使用依非韋倫(EFV)治療的HIV感染患者[19]。Liu等[20]報道，在我國7個省流行的CRF65-cpx毒株存在V179D突變。毒株發生V179D/E突變會導致未接受抗病毒治療的HIV感染患者對非核苷類逆轉錄酶抑制劑(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs)藥物的敏感性降低。本研究結果顯示，重組毒株(B/C/CRF01-AE)存在V179D突變，可判定為潛在耐藥[19,21-23]，因此對攜帶CRF65-cpx毒株HIV感染患者的臨床治療具有一定的挑戰性，需要加強對患者病毒載量和耐藥的監測。

綜上所述，在廣西邊境某市發現的CRF65-cpx病毒株是由B、C和 CRF01-AE亞型毒株重組而成，且含有V179D突變。廣西邊境地區應加強對該亞型或類似新型病毒株的監測并采取相應的預防控制措施，以防止境外新型重組毒株或本地重組毒株在該地區的擴散傳播流行。