堿性成纖維細胞生長因子對腫瘤壞死因子-α聯合放線菌酮協同誘導的人軟骨細胞損傷的保護作用及機制研究

熊成浩 楊波 唐道琪 薛琦 方海洲 王菊芳

1.珠海億勝生物制藥有限公司，廣東珠海 519085；2.億勝生物科技有限公司，香港 999077；3.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006

[關鍵字] 堿性成纖維細胞生長因子；軟骨損傷；細胞凋亡；腫瘤壞死因子-α

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種嚴重影響老年人健康關節性疾病[1-2]，炎癥及炎癥引起的關節軟骨損傷與骨關節炎的發生發展有著密切的聯系[3-4]。近來的研究發現堿性成纖維細胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）在軟骨、神經及心肌修復等過程中扮演重要的角色[5-7]。盡管已有研究報道，bFGF 可以通過促進軟骨細胞的生長，分化及胞外基質的合成修復損傷的軟骨組織[8]，但是bFGF 對炎癥條件誘導的軟骨細胞損傷是否具有保護作用目前并不明確，本研究旨在利用腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和放線菌酮（cycloheximide，CHX）聯合誘導的體外軟骨細胞炎癥損傷模型，探究bFGF 對于軟骨細胞在炎癥環境下的保護作用及機制，為bFGF 在軟骨損傷修復領域的應用提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

膝關節來源的人原代軟骨細胞（4650）購自美國ScienCell 公司，采用人軟骨細胞培養基（4651，Scien-Cell 公司）進行培養，本實驗中所用細胞均使用P3 代細胞。

1.2 主要試劑和儀器

bFGF（珠海億勝，批號：200505）；TNF-α（南京金斯瑞生物科技股份有限公司，Z01001），凋亡試劑盒（BD，556547），JC-1 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，C2006）；MTT（Sigma，M5655）；放線菌酮（上海翊圣生物科技有限公司，40325ES03）；兔抗鼠Bcl-2和Bax 抗體（CST，3498T、5023T）；二氧化碳培養箱（NuAire，NU-5810E）；流式細胞儀（貝克曼，CytoFlex）；化學發光曝光儀（GE；Amersham Imager 680）。

1.3 軟骨細胞損傷模型的建立

96 孔板每孔接種1.0×104個細胞，待匯合度達到70%時棄去上清，給藥組中加入含有1 μmol/L CHX及10、20、50 ng/ml TNF-α 的完全培養基，對照組加入100 μl 完全培養基（無CHX 及TNF-α）。將孔板放置到培養箱中繼續培養48 h 后用MTT 法檢測細胞活力。

1.4 細胞活力的檢測

96 孔板每孔接種1.0×104個細胞，待細胞生長至匯合度達到70%時棄去上清，模型組加入含有1 μmol/L CHX 和50 ng/ml TNF-α 的完全培養基，bFGF 低劑量和高劑量給藥組在模型組給藥的基礎上分別給予1 ng/ml 和10 ng/ml 的bFGF，對照組給予等體積的完全培養基，48 h 后用MTT 法檢測細胞活力。

1.5 細胞凋亡的檢測

12 孔板每孔接種1.0×105個細胞，待細胞匯合度達到70%時進行給藥。給藥組別的設置與“1.4”一致，藥物處理48 h 后，使用流式檢測試劑盒對各組細胞進行染色，隨后采用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡。

1.6 線粒體損傷的檢測

12 孔板每孔接種1.0×105個細胞，細胞匯合度達到70%時進行給藥。給藥組別的設置與“1.4”一致，48 h 后收集細胞，JC-1 染色后采用流式細胞儀進行檢測。

1.7 Bcl-2 和Bax 凋亡相關蛋白的檢測

12 孔板每孔接種1.0×105個細胞，待細胞匯合度達到70%時進行給藥，給藥組別的設置與“1.4”一致，24 h 后用RIPA 裂解液充分裂解細胞后收集總蛋白提取液。對總蛋白進行電泳后轉膜、封閉、孵育一抗和二抗、漂洗后進行顯影，采用Image J 7.0 軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，以GAPDH 為內參，計算目標蛋白的相對表達量。

1.8 統計學方法

采用SPSS 18.0 軟件對所得數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，采用t 檢驗或方差分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α 聯合CHX 誘導軟骨細胞損傷的模型建立

1 μmol/L CHX 聯合10、20、50 ng/ml TNF-α 的實驗組軟骨細胞活力[（72.85±9.38）%、（67.88±1.25）%、（56.95±4.82）%]低于對照組，差異有高度統計學意義（F=24.870，P ＜0.001）。當TNF-α 為50 ng/ml 時，細胞活力下降約一半，為較為適宜的誘導劑量。因此，采用1 μmol/L CHX 聯合50 ng/ml 的TNF-α 建立軟骨細胞損傷模型。

2.2 bFGF 對TNF-α/CHX 損傷的軟骨細胞活力的影響

bFGF 低劑量和高劑量組的細胞活力[（77.34±7.23）%、（86.51±6.48）%]與模型組比較，差異有統計學意義（t=3.218，P ＜0.05；t=5.501，P ＜0.01）。見圖1。

圖1 不同給藥組別軟骨細胞的細胞活力比較（n=3）

2.3 bFGF 對TNF-α/CHX 損傷的軟骨細胞凋亡的影響

與對照組比較，模型組凋亡率明顯升高，差異有高度統計學意義（t=21.87，P ＜0.001），而bFGF 低劑量和高劑量組凋亡率低于模型組，差異有統計學意義（t=3.320，P ＜0.05；t=5.415，P ＜0.01）。見圖2、表1。

圖2 流式檢測各給藥組軟骨細胞的凋亡情況

表1 不同組別軟骨細胞凋亡率比較（%，，n=3）

表1 不同組別軟骨細胞凋亡率比較（%，，n=3）

注 與對照組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。bFGF：堿性成纖維生長因子

2.4 bFGF 對軟骨細胞線粒體損傷的影響

模型組細胞FITC 陽性細胞比率高于對照組，差異有高度統計學意義（t=15.41，P ＜0.001）。而bFGF的給藥可以降低FITC 的陽性細胞比率，高劑量bFGF 組FITC 陽性細胞比率低于模型組，差異有高度統計學意義（t=6.684，P ＜0.01）。見圖3、表2。

表2 不同組別細胞JC-1 染色后FITC 陽性細胞比率比較（%，，n=3）

表2 不同組別細胞JC-1 染色后FITC 陽性細胞比率比較（%，，n=3）

注 與對照組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.01。bFGF：堿性成纖維生長因子

圖3 JC-1 染色檢測各組別軟骨細胞線粒體的損傷情況

2.5 bFGF 對Bcl-2 和Bax 蛋白表達水平的影響

模型組細胞Bcl-2 的表達水平低于對照組，Bax的表達水平高于對照組，差異有高度統計學意義（t=9.863，P ＜0.01；t=7.357，P ＜0.01）。但是在給予bFGF后，高劑量組Bcl-2 蛋白的表達水平高于模型組，差異有統計學意義（t=2.838，P ＜0.05）；低劑量組和高劑量組Bax 蛋白的表達水平低于模型組，差異有統計學意義（t=4.198，P ＜0.05；t=4.726，P ＜0.01）。見圖4、表3。

圖4 Western blot 檢測軟骨細胞線粒體損傷和凋亡相關蛋白Bcl-2 和Bax 的表達

表3 不同組別細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax 表達水平比較（%，，n=3）

表3 不同組別細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax 表達水平比較（%，，n=3）

注 與對照組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bbP ＜0.01，bP ＜0.05。bFGF：堿性成纖維生長因子

3 討論

TNF-α 是一種多功能的炎癥細胞因子，主要來源于巨噬細胞、纖維母細胞及內皮細胞等[9-11]。體外培養的條件下，炎癥因子對軟骨細胞的細胞活力無明顯影響，致敏劑CHX 可以抑制細胞內cFLIP 生成，與炎癥因子聯用可以有效地誘導細胞損傷[12-13]。Lee等[14]采用CHX 與TNF-α 聯用誘導軟骨細胞損傷，建立了軟骨細胞炎癥損傷模型。在本研究中，1 μmol/L CHX 存在的條件下，TNF-α 可以明顯地降低軟骨細胞的活力，并且具有劑量依賴的趨勢，當TNF-α 為50 ng/ml 時細胞活力接近50%，為較為適宜的誘導劑量，因此選擇該條件作為建立軟骨細胞損傷模型的條件。

bFGF 具有組織修復、血管生成及神經營養等生物學功能[15-18]。Li等[19]研究結果顯示，關節關節軟骨組織中bFGF 的缺失可以明顯促進軟骨的凋亡和壞死。此外，體外培養實驗顯示10 ng/ml 的bFGF 可以強烈促進人原代軟骨細胞的增殖，上調軟骨細胞膠原蛋白和蛋白聚糖的表達[20]，這些研究顯示bFGF 對軟骨增殖，分化和存活等具有重要的影響。本研究結果顯示，與模型組比較，bFGF 能有效上調軟骨細胞的細胞活力，提示bFGF 對軟骨細胞的損傷具有明顯的保護作用。

近年來的研究顯示，bFGF 可以抑制凋亡、自噬等多種途徑實現對各種細胞的保護作用。Liu等[21]研究顯示在U251 細胞中，bFGF 的敲減可以降低線粒體的膜電位，促進細胞凋亡。本研究結果也顯示，bFGF可以有效地保護線粒體的功能，抑制模型細胞的凋亡。Bcl-2 和Bax 是與細胞凋亡密切相關的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白[22]，Tong等[23]研究顯示在缺氧誘導的心肌細胞損傷模型中，bFGF 可以顯著抑制模型細胞Bax 的表達，上調Bcl-2 的表達，從而抑制心肌細胞凋亡的發生，這與本研究結果具有一定的相似性，而bFGF 的這一作用也在神經細胞、血管平滑肌細胞和腎臟細胞的相關研究中得到了證實[24-26]。

綜上所述，bFGF 可以通過抑制線粒體膜的損傷，保護線粒體的功能，調控線粒體凋亡相關蛋白Bax 和Bcl-2 的表達等機制抑制軟骨細胞的炎癥損傷，具有一定的治療前景。