星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化野黃芩苷鎂溫敏型鼻用原位凝膠的制備

王雨欣，常金花，楊 菲，劉翠哲

(承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實驗室，河北 承德 067000)

野黃芩苷又名燈盞花乙素，是從干燥全草燈盞細(xì)辛中分離得到的燈盞花素的主要成分，屬于黃酮類活性成分，其臨床主要用于心腦血管疾病的治療[1]。石森林等[2-3]將燈盞花素制成溫敏型原位凝膠，對腦缺血等心腦血管疾病有明顯的改善作用，且效果優(yōu)于靜脈注射。

研究表明黃酮類化合物與金屬離子反應(yīng)成鹽后，不僅能提高溶解度，還可以增強(qiáng)生物活性[4]。鎂離子是人體必須的常量元素，具有保肝、抗缺血再灌注損傷等廣泛的藥理作用，且心腦血管疾病的發(fā)病因素與鎂也有關(guān)[5-6]。因此本課題組在前期研究中，以野黃芩苷和氫氧化鎂為原料，化學(xué)合成法制備了野黃芩苷鎂鹽，其溶解度顯著高于野黃芩苷，而且其對抗腦缺血再灌注損傷的藥效明顯優(yōu)于野黃芩苷[7]。鼻腔給藥系統(tǒng)[8-9]是藥物達(dá)到腦部靶向作用的途徑之一，藥物分子與鼻黏膜長時間接觸，從而被吸收，并繞過血-腦屏障進(jìn)入腦部，起到治療作用，且效果優(yōu)于注射等其他給藥途徑。溫度敏感型原位凝膠[10-11]低溫時呈液態(tài)，溫度升高便形成凝膠狀態(tài)，可黏附于鼻黏膜表面，從而延長藥物在鼻腔中的作用時間，提高生物利用度，并能有效解決鼻纖毛對藥物的清除作用，提高藥效。因此，本課題將野黃芩苷鎂制成鼻用溫敏型原位凝膠，采用星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化其處方。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LGJ-22D冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)；ZNCL-GS智能數(shù)顯磁力(加熱鍋)攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；METTLERTOLEDO實驗室pH計(瑞士梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；JA2003型電子天平(上海精科天平儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

野黃芩苷鎂(自制，批號：20201224，純度：96.86%)；野黃芩苷對照品(源葉生物，批號：B21478，純度：HPLC≥98%)；泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)(北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司)；NaOH(天津歐博凱化工有限公司)；磷酸氫二鉀(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；氫氧化鎂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；乙腈、甲醇、磷酸(色譜純，美國MREDA公司)；純凈水(天津娃哈哈食品有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溫度敏感型原位凝膠的制備

采用冷溶法[12]制備黃芩苷鎂溫敏型原位凝膠。首先，分別精密稱取處方量的P407和P188，置于50 mL燒杯中，加入純水10 mL，攪拌溶解。在4 ℃環(huán)境下存放24 h以上，充分溶脹，得到澄清、無氣泡、無團(tuán)塊的空白凝膠基質(zhì)；再取處方量的野黃芩苷鎂，精密稱定，置于空白凝膠基質(zhì)中，在常溫下攪拌混勻，直至野黃芩苷鎂全部溶解，放入4 ℃冰箱24 h得到野黃芩苷鎂溫敏型原位凝膠。

2.2 相變溫度(T)的測定

采用攪拌子法[13]測定。據(jù)文獻(xiàn)報道，溫度在25～27 ℃之間，溫敏凝膠易在體外發(fā)生相變[14]，但夏季溫度高，其在室溫便會成凝膠狀態(tài)，需低溫保存，依據(jù)鼻腔的生理溫度(29～34 ℃)[15]，來選擇各輔料的用量。

2.3 P407和P188對T的影響

采用單因素試驗設(shè)計，制備含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的P407和P188的凝膠來考察兩者之間的關(guān)系。從結(jié)果分析，隨著P407的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，T降低，如圖1，P407濃度≤15%時，在測試溫度范圍內(nèi)不形成凝膠，當(dāng)濃度>25%時，溫度過低，易在室溫下就形成凝膠，但當(dāng)P407濃度為23%和25%時，不僅T低，且P407用量也多，所以將P407的濃度范圍定為17%～21%；而當(dāng)P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，T升高，并且當(dāng)P407濃度小于21%時，加入1%的P188，T也會過高，因此將P188的濃度定為0%～1%，見圖2。

圖1 溶液的相變溫度隨著P407濃度變化曲線

圖2 P188對不同濃度P407相變溫度的影響

2.4 處方優(yōu)化

2.4.1 試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取P407的范圍為17%～21%，P188的范圍為0%～1%。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法原理，每個因素五水平，分別為：±1.414，±1，0。兩因素水平及結(jié)果見表1和表2。

表1 效應(yīng)面設(shè)計因素與水平

表2 實驗設(shè)計及響應(yīng)值

2.4.2 模型擬合

采用Design-Expert10軟件對兩因素與T進(jìn)行回歸分析，得到二項式方程為Y=30-4.74A+0.94B-0.5000AB+2A2-0.25B2(R2=0.9779，P<0.000 1)，P<0.000 1，表明兩因素與T之間具有顯著的相關(guān)性；R2(相關(guān)系數(shù))為0.977 9，說明該模型具有一定的可靠性；AdjR-Squared(校正擬合度)為0.962 2和PredR-Squared(預(yù)測擬合度)為0.843 1，兩者的差值<0.2，說明該二元多項式方程的擬合度和可信度較高。綜上所述，該模型的預(yù)測性可靠，結(jié)果見表3。

表3 二項式方程擬合模型方差分析結(jié)果

2.4.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 用Design-Expert10軟件生成兩因素對T的二維等高線圖和三維效應(yīng)面圖，見圖3。試驗結(jié)果與單因素試驗結(jié)果一致。得處方：P407 19%、P188 0.5%。

圖3 各因素對相變溫度影響的二維等高線及三維效應(yīng)面

2.4.4 工藝驗證 按預(yù)測的最優(yōu)處方制備野黃芩苷鎂鼻用溫敏型原位凝膠3份，測T，見表4。預(yù)測值與實際值接近，表明該優(yōu)化過程可靠。

表4 優(yōu)化處方及結(jié)果 (℃)

2.5 野黃芩苷鎂溫敏型原位凝膠的外觀檢查和pH值

按照“2.4.4”項下方法制備3批野黃芩苷鎂溫敏型原位凝膠，進(jìn)行pH值的測定，并且用肉眼觀察其性狀，結(jié)果見表5。依據(jù)2020版《中華人民共和國藥典》四部的制劑通則，本研究制備的野黃芩苷鎂溫敏型原位凝膠的外觀和pH值均符合鼻用制劑的相關(guān)規(guī)定。

表5 野黃芩苷鎂原位凝膠pH及外觀的測定結(jié)果

2.6 含量測定方法的建立

2.6.1 色譜條件[16]Agilent C18色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸水(22∶78，V∶V)，檢測波長為335 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.6.2 溶液制備 對照品溶液：精密稱取10.02 mg野黃芩苷對照品，加甲醇超聲定容，制成196.392 μg/mL的對照品溶液。供試品溶液：精密稱取1 mL野黃芩苷鎂鼻用溫敏型原位凝膠于100 mL容量瓶中，加純水超聲定容，搖勻，即得。陰性對照溶液：精密稱取空白凝膠適量，同供試品溶液制備，得陰性對照溶液。

2.6.3 專屬性考察 按照色譜條件，取“2.6.2”項下溶液各10 μL進(jìn)樣，對照品中野黃芩苷和供試品中野黃芩苷鎂與其他組分可基線分離，陰性對照品在野黃芩苷鎂位置處無干擾，結(jié)果見圖4。

圖4 專屬性考察結(jié)果

2.6.4 線性關(guān)系考察 取“2.6.2”項下的對照品溶液用甲醇成倍稀釋，得6.137、12.275、24.54、49.098、98.196、196.392 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC測定，得標(biāo)準(zhǔn)曲Y=30.72X-246.83，R2=0.999 0，表明野黃芩苷在6.137～196.392 μg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.6.5 精密度試驗 吸取“2.6.2”項下的對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算RSD值為0.56%，表明儀器精密度良好。

2.6.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于室溫下保存，分別于0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣測定，計算RSD值為1.06%，表明該樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.7 重復(fù)性試驗 精密稱取野黃芩苷鎂鼻用溫敏型原位凝膠共6份，制成供試品溶液，按色譜條件測定，RSD為0.68%。

2.6.8 加樣回收率試驗 取野黃芩苷鎂原位凝膠0.5 mL(相當(dāng)于野黃芩苷鎂2.45 mg)，分別加入野黃芩苷對照品溶液(101.4 μg/mL)20 mL，25 mL，30 mL各3份，制成供試品溶液，按色譜條件測定。結(jié)果見表6。

表6 野黃芩苷鎂原位凝膠的加樣回收率試驗

2.7 野黃芩苷鎂鼻用溫敏原位凝膠的含量測定

精密稱取野黃芩苷鎂鼻用溫敏型原位凝膠6份，制成供試品溶液，按色譜條件測定，計算平均值，得野黃芩苷鎂含量為4.907 mg/mL。

表7 野黃芩苷鎂鼻用溫敏原位凝膠的含量測定 (mg/mL)

3 討論

為了提高野黃芩苷鎂的生物利用度，本試驗以P407和P188為凝膠基質(zhì)。泊洛沙姆是一種由聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)組成的PEO-PPO-PEO型非離子三嵌段共聚物，具有良好的安全性[17]。且低溫時為液態(tài)，高溫便轉(zhuǎn)變成凝膠狀態(tài)，這是因為溶液-凝膠轉(zhuǎn)化溫度受PEO/PPO比例、聚合物濃度等的影響[18]。但由于單獨(dú)使用P407時，凝膠的黏附力與機(jī)械性能比較差[19]，所以添加少量的P188。P188對溶液的凝膠化溫度與P407有相反的影響，這些影響是由于這兩種化合物中存在的親水性PEO和疏水性PPO的比例不同造成的。P188 PEO鏈含量更高，因而親水性更強(qiáng)，PEO鏈跟水分子形成的氫鍵數(shù)目更多，因而高分子鏈?zhǔn)艿狡茐牡哪z凝溫度更高。因此，添加P188除了增加凝膠黏附性外，還可以來調(diào)節(jié)凝膠溫度[20-22]

星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法[23-25]是一種運(yùn)用效應(yīng)曲面模型分析的多因素五水平的新型實驗設(shè)計方法，且各因素間的相互影響都能充分考慮到，中心點(diǎn)實驗進(jìn)行多次重復(fù)，可信度較好，準(zhǔn)確性高。本研究采用此方法，設(shè)計優(yōu)化原位凝膠的處方，結(jié)果表明按照最優(yōu)處方制備的溫敏型原位凝膠的相變溫度的實測值與預(yù)測值非常接近，證明本研究建立的回歸方程預(yù)測性良好。按照篩選出的最優(yōu)處方制備的野黃芩苷鎂鼻用溫敏型原位凝膠，其膠凝溫度適宜。