阿奇霉素及其雜質J對斑馬魚毒性的轉錄組學分析

陳寧 黃權華 蘇軍權 張苗青,2 張靖溥

(1 深圳華潤九新藥業有限公司，深圳 518049；2 中國醫學科學院/北京協和醫學院醫藥生物技術研究所，國家衛生健康委員會抗生素生物工程重點實驗室，抗感染藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050)

阿奇霉素(azithromycin)是一種由紅霉素結構修飾得到的第二代大環內酯類抗生素，在臨床上廣泛應用于呼吸道感染或皮膚和軟組織感染等[1-2]。張斗勝等對不同鹽形式的國產注射用阿奇霉素中雜質譜進行考察，發現酸降解物3'-去克拉定糖阿奇霉素(雜質J)為主要降解產物[3-4]。由于阿奇霉素的C9位羰基被修飾，不能發生縮酮化反應，因此與紅霉素相比，對酸更穩定[5]。但口服阿奇霉素片劑在胃液中釋放后能被迅速水解成雜質J，而阿奇霉素腸溶膠囊可較好地解決阿奇霉素在體內產生雜質J這一問題[6-7]。為揭示雜質J可能誘發的毒副作用及其機制，為臨床更好地應用阿奇霉素制劑提供選擇依據，本文利用模式動物斑馬魚通過轉錄組學分析，探討阿奇霉素及雜質J的可能毒性作用及差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

斑馬魚(Danio rerio)野生型AB系，飼養方法和受精卵收集參照文獻[8]。本研究中選用發育正常的3 dpf(3 day post fertilization)斑馬魚幼魚用于后續實驗。本實驗程序符合中國醫學科學院醫藥生物技術研究所的動物實驗倫理規則，并獲得所實驗動物管理委員會的準許。

1.1.2 試劑

阿奇霉素(批號130352-201808)和阿奇霉素雜質J(批號130650-200901)標準品由中國食品藥品檢定研究院饋贈，純度為95%。Trizol試劑和二甲亞砜(DMSO)自Invitrogen公司購買。

1.2 方法

1.2.1 LD5和LD50測定

參照文獻[8-9]的方法，發育正常的3 dpf斑馬魚幼魚分別給與不同濃度的阿奇霉素和雜質J(0.5、1、2、3、4和5 mmol/L)，每組各30條。給藥3 d后，統計不同濃度的兩種化合物導致的斑馬魚幼魚死亡數，計算死亡率(%)，繪制“致死率-濃度”效應曲線，并計算阿奇霉素和雜質J對斑馬魚幼魚整體毒性的LD5和LD50值。

1.2.2 轉錄組學分析

參照文獻[10]的方法，3 dpf野生型斑馬魚幼魚置于相同濃度的阿奇霉素和雜質J (2 mmol/L)藥液中，每組各20條，培養3 d后，Trizol法提取總 RNA，轉錄組測序及原始數據分析由北京博奧生物科技有限公司完成。將P＜0.05顯著差異的轉錄本進行GO富集分析。

1.2.3 實時熒光定量PCR

參照文獻[8-9]的方法，斑馬魚幼魚(3 dpf)分別給與不同濃度的阿奇霉素和雜質J (0.5、1和2 mmol/L)，每組各20條，給藥3 d后，Trizol法提取組織總RNA，利用LightCycler 480熒光實時定量PCR儀進行擴增，以β-actin為內參基因，基因相對mRNA表達量用2-ΔΔCt方法計算。所用引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 Primers used in the qRT-PCR analysis

1.3 統計學分析

除RNA-seq分析外，所有實驗均重復3次，所有數據均以(x_±s)表示，GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析并制圖。t檢驗分析組間差異，P＜0.05認為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 阿奇霉素和雜質J對斑馬魚幼魚的整體毒性

3 dpf斑馬魚幼魚分別置于不同濃度的阿奇霉素和雜質J溶液(0.5、1、2、3、4和5 mmol/L)中培養，3 d后，統計每組斑馬魚幼魚死亡率，繪制兩種化合物的致死率-濃度曲線(圖1)，計算出阿奇霉素對斑馬魚幼魚的LD5和LD50，分別為0.71 mmol/L和3.10 mmol/L，雜質J的LD5和LD50分別為0.68 mmol/L和3.16 mmol/L，結果表明阿奇霉素和雜質J對斑馬魚幼魚整體毒性沒有顯著差異。

2.2 差異基因表達分析

利用轉錄組學分析(RNA-seq)進一步揭示阿奇霉素和雜質J對斑馬魚的毒性反應機制，結果表明，兩種化合物在轉錄水平均可導致幼魚的基因表達譜發生明顯改變，且二者導致發生顯著性變化的基因個數不同，與對照組相比，阿奇霉素導致了1257個基因發生顯著性變化，其中上調基因有797個，下調基因有460個，雜質J導致了1190個DEGs，其中上調基因有688個，下調基因有502個(圖2A)。去除未知基因后，阿奇霉素與雜質J共同調節的差異基因個數為49個，阿奇霉素單獨調節26個DEGs，雜質J單獨調節21個DEGs(圖2B)。提示二者可能通過影響體內不同的生理過程導致毒性反應的發生。

2.3 差異基因GO歸類分析

進一步對兩種化合物調節的DEGs通過基因本體(GO)數據庫進行功能歸類分析(圖3)。阿奇霉素調節的DEGs歸類到GO生物過程(變化倍數＞3，P＜0.05)分別為碳水化合物代謝過程(carbohydrate metabolic process)、海藻糖代謝過程(fucose metabolic process)、碳水化合物衍生物分解代謝過程(carbohydrate derivative catabolic process)、糖脂分解代謝過程(glycolipid catabolic process)和TOR信號通路的正調控(positive regulation of TOR signaling)等。雜質J調節的DEGs歸類到GO生物過程分別為碳水化合物代謝過程(carbohydrate metabolic process)、免疫反應(immune response)、碳水化合物衍生物分解代謝過程(carbohydrate derivative catabolic process)、小分子代謝過程(small molecule metabolic process)和氨基糖代謝過程(amino sugar metabolic process)等。上述阿奇霉素單獨調節的26個DEGs中有4個基因歸屬于顯著差異性GO生物過程(變化倍數＞3，P＜0.05)，其中ctsc、gnpda和gck基因歸屬于碳水化合物及碳水化合物衍生物等代謝過程，tmem127基因歸屬于TOR信號相關生物過程，與細胞生長密切相關。雜質J單獨調節的21個DEGs中只有1個基因(cxcl8b.1基因)歸屬于顯著差異性GO生物過程(變化倍數＞3，P＜0.05)，屬于免疫反應相關生物過程。阿奇霉素單獨調節的4種DEGs中ctsc和gnpda基因顯著上調，而gck和tmem127基因顯著下調；雜質J單獨調節的cxcl8b.1基因顯著上調。上述結果提示阿奇霉素和雜質J均可能影響機體的代謝過程，而雜質J還可能會影響機體的免疫反應過程。

2.4 qRT- PCR分析

為驗證上述RNA-seq檢測結果，利用qRT-PCR對阿奇霉素和雜質J可單獨調節的差異基因進行檢測。結果表明阿奇霉素可單獨調節的ctsc、gnpda、gck和tmem127基因以及雜質J可單獨調節的cxcl8b.1基因表達變化與RNA-seq測序結果相似，并呈濃度依賴性(圖4)。

3 討論

阿奇霉素的主要酸降解產物是雜質J，本研究利用模式動物斑馬魚分析阿奇霉素及其雜質J在體內毒性反應的異同。兩種化合物對斑馬魚幼魚的急性毒性反應沒有顯著性差異；但轉錄組學分析發現，阿奇霉素可單獨調節ctsc、gnpda、gck和tmem127基因，它們與體內的生物代謝與細胞生長(TOR信號相關的生物過程)過程有關；而雜質J可單獨調節cxcl8b.1基因，與體內免疫反應過程相關；提示二者在體內導致的生理反應并不完全相同。

cxcl8b.1基因編碼的interleukin-8b.1蛋白是促炎癥因子，該基因高表達可使機體炎癥途經被激活，進而可能誘導炎癥特征性體征，例如腫脹、發熱、疼痛、發紅和功能喪失等[11-12]。目前兒童使用注射用阿奇霉素時會有輸注部位疼痛和急性嚴重過敏反應等不良反應[13]，而國產阿奇霉素片劑在使用過程中更易發生胃腸道反應等不良反應(未發表資料)，這些不良反應的產生是否與雜質J有關仍需進一步的研究。

本文明確了阿奇霉素與雜質J對機體生理過程的影響具有明顯差異，為深入探討阿奇霉素不同劑型-雜質-不良反應的關系提供了研究方向，對阿奇霉素產品的質量控制和制劑的臨床應用均具有重要意義。