穴位埋線對去勢骨質(zhì)疏松大鼠BMD、BMSCs、ALP及TGF-β信號通路的影響

陳 菁，曾麗蓉，龔海峰，謝菊英

(1.湘南學(xué)院 康復(fù)學(xué)院，湖南 郴州423000；2.湘南學(xué)院附屬康復(fù)醫(yī)院，湖南 郴州 423000； 3.湘南學(xué)院第一附屬醫(yī)院，湖南 郴州423000)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis，PMO)是骨質(zhì)疏松癥的主要類型之一。其發(fā)病機制與婦女絕經(jīng)后的卵巢功能減弱、雌激素水平降低有關(guān)，卵巢功能減弱可能引起骨的吸收生成，進(jìn)而出現(xiàn)以骨量低下、骨組織的顯微結(jié)構(gòu)退行性變?yōu)樘卣鞯墓琴|(zhì)疏松[1-2]，該病是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨強度降低、骨脆性增加及易發(fā)生骨折為臨床特征的全身代謝性骨骼疾病[3]。據(jù)國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報道PMO發(fā)病率約為20.7%，且隨年齡增加發(fā)病率逐漸提高，已逐漸成為我國嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題[5]。因此，選取簡便性、廉價性及安全性高的治療靶點是治療PMO的首選。

近年來，醫(yī)學(xué)界大力提倡采用中西醫(yī)結(jié)合的方法治療骨質(zhì)疏松，穴位埋線作為臨床應(yīng)用較廣泛的方法之一，已得到國內(nèi)外學(xué)者的認(rèn)可[6]。穴位埋線的主要機制是在中醫(yī)針灸學(xué)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段，將特質(zhì)的可吸收蛋白線置入穴位內(nèi)，刺激穴位產(chǎn)生持續(xù)的化學(xué)反應(yīng)，從而達(dá)到治病的目的，但是對于穴位埋線的調(diào)控機制機理，目前尚缺乏系統(tǒng)性研究。本研究在中醫(yī)“腎主骨”理論指導(dǎo)下，通過前期臨床實踐發(fā)現(xiàn)通過穴位埋線等方法刺激“腎”相關(guān)腧穴能夠有效改善骨質(zhì)疏松癥。因此，本研究基于“腎主骨”理論，通過對SD大鼠PMO模型進(jìn)行穴位埋線，觀察穴位埋線對大鼠BMD、BMSCs、ALP蛋白及TGF-β信號通路的調(diào)控作用，以期為“腎主骨”的穴位埋線治療PMO基礎(chǔ)理論提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

選用3月齡SD雌性大鼠，SPF級(Ⅱ級)，體質(zhì)量220 g左右(由煙臺安蒙氏生物醫(yī)藥有限公司提供，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(湘) 2013-0004，飼養(yǎng)溫度 18～25℃，標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂養(yǎng))。實驗過程中對動物的處置符合國家科技部 2006 年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 實驗器材及試劑

選用12號埋線針，裝入1/0號羊腸線8 mm；α-MEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；血清骨堿性磷酸酶(BALP)試劑盒(上海碧云天生物)；Herocell C1型CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海潤度生物)；BCM-1000A-5702R型低速離心機；骨鈣素(OC)和I型原膠 N-端前膚(PINB) 測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

2 方法

2.1 實驗動物分組及造模

將48只3月齡健康雌性SD大鼠，SPF級(Ⅱ級)，隨機分為正常組、模型組、穴位埋線組、非穴位埋線組，每組各12只。模型制備：選取48只3月齡健康雌性SD大鼠，SPF級(Ⅱ級)，所有實驗動物自由攝水和進(jìn)食。造模前飼養(yǎng)大鼠7天以適應(yīng)環(huán)境，腹腔注射20%烏拉坦(4 mL/kg)進(jìn)行麻醉，所有大鼠均以背側(cè)入路方式行完整雙測卵巢摘除術(shù)。術(shù)后青霉素生理鹽水(4萬U/mL)肌注預(yù)防感染，每日注射1.5 mL，連續(xù)3 d。

2.2 干預(yù)手段

穴位埋線組干預(yù)方法：依據(jù)《動物針灸穴位圖譜》(中國針灸學(xué)會實驗針灸研究會制)，選取腎俞、京門為主穴，腎俞位于第二腰椎下兩旁，京門位于最后一肋游離端下緣。在模型造模成功即開始穴位埋線(醫(yī)用可吸收蛋白線)，每10日1次，3次為1個療程，療程間間隔3 d，共治療3個月(3個療程)[7]。

非穴位埋線組干預(yù)方法：非經(jīng)非穴點選腎俞、京門各穴旁5 mm處；處理時間及療程同穴位埋線組。

正常組和模型組干預(yù)方法：不進(jìn)行任何治療，正常飼養(yǎng)3個月。

2.3 標(biāo)本采集與檢測

2.3.1 骨密度(BMD) 治療3個月后大鼠仰臥位置于QDR-4500A雙能X線骨密度診斷儀上，測量分析股骨近端干骺端及第4腰椎、第5腰椎骨密度。

2.3.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs) 采用脫臼法處死SD大鼠，無菌條件下取出大鼠股骨和脛骨，用完全培養(yǎng)液沖洗骨髓腔且收集沖洗液。高轉(zhuǎn)速離心獲得細(xì)胞沉淀液，采用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，進(jìn)行傳代，當(dāng)進(jìn)行第3-4代細(xì)胞傳代時可得出BMSCs表達(dá)水平。用ELISA法檢測骨鈣素(OC)和I型原膠原N-端前肽(PINP)含量水平[8]。

2.3.3 堿性磷酸酶(ALP)蛋白活性測定 采用免疫組織化學(xué)(SABC) 染色法，光學(xué)顯微鏡下觀察股骨組織ALP蛋白表達(dá)水平[9]。

2.3.4 轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)蛋白 通過RT-qPCR法檢測TGF-β的mRNA蛋白表達(dá)水平[10]。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 穴位埋線對SD大鼠骨密度的影響

治療3個月后，與正常組腰椎、股骨BMD水平比較，模型組明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)埋線治療后，與正常組和模型組相比，穴位埋線組和非穴位埋線組腰椎、股骨BMD均有明顯提高(P<0.05)，且穴位埋線組腰椎、股骨BMD水平比非穴位埋線組更高(P<0.05)。見表1。

表1 各組腰椎、股骨BMD對比

3.2 穴位埋線對SD大鼠BMSCs中IC增殖作用影響

治療3個月后，與正常組BMSCs中OC和PINP對比，模型組明顯降低正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)埋線治療后，與正常組和模型組相比，穴位埋線組、非穴位埋線組BMSCs中OC和PINP水平均明顯提高(P<0.05)，且穴位埋線組BMSCs中OC和PINP水平高于非穴位埋線組(P<0.05)。見表2。

表2 各組BMSCs中OC和PINP含量對比

3.3 穴位埋線對SD大鼠ALP蛋白的影響

與正常組相比，模型組ALP表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)埋線治療后，與正常組和模型組相比，穴位埋線組、非穴位埋線組ALP表達(dá)水平均明顯增強(P<0.05)，且穴位埋線組ALP表達(dá)水平優(yōu)于非穴位埋線組(P<0.05)。見表3。

表3 各組ALP蛋白對比

3.4 穴位埋線對SD大鼠TGF-β蛋白水平的影響

經(jīng)RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常組對比，模型組TGF-β mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)埋線治療后，與正常組和模型組相比，穴位埋線組、非穴位埋線組TGF-β mRNA表達(dá)水平均明顯增強(P<0.05)，且穴位埋線組TGF-β mRNA表達(dá)水平優(yōu)于非穴位埋線組(P<0.05)。見表4。

表4 各組TGF-β蛋白表達(dá)水平對比

4 結(jié)論

原發(fā)性骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，OP)是常見的中老年疾病之一，早期多無明顯癥狀，后期多出現(xiàn)骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、骨強度降低及以易發(fā)生骨折為特征的全身性代謝性骨骼疾病[11]，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者約占所有骨質(zhì)疏松患者的80%。目前，其發(fā)病機制多認(rèn)為是由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，炎性因子表達(dá)水平增加，引起破骨細(xì)胞的生成增加、凋亡減少，導(dǎo)致骨吸收和重建代謝失衡所致[12]。

基于上述理論分析，目前雌激素補充劑作為主要治療方案之一。主要通過雌激素補充促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、抑制破骨細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用[13]。但藥物干預(yù)往往是終身性的，昂貴的治療費用已成為家庭和社會的沉重負(fù)擔(dān)。中醫(yī)藥治療方法因其簡便性、廉價性、安全性及有效性被廣泛應(yīng)用于臨床，甚至作為替代療法已逐漸取代普通藥物干預(yù)。POM屬祖國醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨痹”“腰痛”“骨枯”“骨極”等病證的范疇，發(fā)病之本在于腎虛。腎為“先天之本”，主骨生髓。腎藏精，精生髓，髓居骨中，骨賴髓以充養(yǎng)，腎氣盛衰與骨的生長發(fā)育密切相關(guān)。骨質(zhì)疏松正是病邪侵襲導(dǎo)致痰瘀困阻、氣血不調(diào)而發(fā)病[14]。穴位埋線基于中醫(yī)針灸學(xué)思想，結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)手段，通過將可吸收的蛋白線置入穴位內(nèi)，在穴位內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的物理及化學(xué)反應(yīng)，通過這種對腧穴的持續(xù)刺激以達(dá)到治療疾病的目的[15]。本研究通過前期文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)目前國內(nèi)外鮮有文章報道穴位埋線對PMOP調(diào)控機制機理的系統(tǒng)性研究。因此，本研究小組通過總結(jié)多年臨床經(jīng)驗，提出基于“腎主骨”理論，通過穴位埋線對調(diào)節(jié)去勢SD大鼠BMD、BMSCs、 ALP蛋白及TGF-β蛋白水平的調(diào)控機制，以求揭示穴位埋線治療PMOP的分子調(diào)控機制。

其中，BMSCs作為骨髓基質(zhì)的重要組成成分，是人體內(nèi)成骨分化和骨形成的重要細(xì)胞來源，在體外也具有分化為成骨細(xì)胞的潛能。同時其作為成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的前體細(xì)胞，在骨的生長和重建過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用[16]。當(dāng) BMSCs 出現(xiàn)定向分化功能異常時，成骨細(xì)胞減少，脂肪細(xì)胞增多，成脂、成骨分化失衡，最后引發(fā)骨質(zhì)疏松。此外，堿性磷酸酶(ALP)作為骨代謝和骨形成的標(biāo)志物，對成骨細(xì)胞凋亡有重要的分子作用機制，其活性的高低是BMSCs成骨細(xì)胞分化的重要指標(biāo)之一[17]。BMSCs的成骨分化是多條信號調(diào)控通路共同參與的復(fù)雜過程。TGF-β作為主要信號通路之一，能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化起到關(guān)鍵作用，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制其向脂肪細(xì)胞分化，通過調(diào)控BMSCs維持骨代謝平衡，提高骨密度，從而達(dá)到防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的目的[18]。

本研究結(jié)果顯示，模型組SD大鼠BMD、BMSCs、ALP蛋白及TGF-β蛋白水平含量均明顯低于其他3組。當(dāng)采取穴位埋線干預(yù)后，BMD、BMSCs、ALP蛋白及TGF-β蛋白水平與模型組相比有明顯提高，推測其可有效提高BMSCs成骨細(xì)胞生成，減少破骨細(xì)胞，提高BMD，從而在骨的生長和重建過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。此外，ALP、TGF-β蛋白可參與調(diào)控BMSCs作用，達(dá)到維持平衡的骨代謝水平，從而達(dá)到防治和延緩絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的目的。另外，穴位組和非穴位組相比，穴位組分子調(diào)控更好，證明了基于“腎主骨”理論的正確性，通過京門和腎俞穴位的刺激，對PMOP分子調(diào)控更具有靶向性。不過由于人力、物力等資源有限，本研究實驗過程引起的BMSCs定向成骨誘導(dǎo)分化、信號通路相互交錯干擾及個體化應(yīng)用等問題只能作為下一步的研究重點進(jìn)行研究。