經典名方芍藥甘草湯物質基準制備工藝及質量研究

劉曉美，孫志強，王 翔，王 權，左成彬，牛保力，李翔宇*

(1.山東禹澤藥康產業技術研究院有限公司，山東 德州 251200；2.安徽濟人藥業有限公司, 安徽 亳州 236800；3.中藥提取安徽省技術創新中心，安徽 亳州 236800)

芍藥甘草湯始載于東漢醫家張仲景所著《傷寒論》，由芍藥、甘草兩味藥組成，臨床應用歷史悠久，安全性高，療效確切。該方配伍精簡，具有和營散逆、舒攣止痛的功效[1]。經典名方對藥材來源、飲片炮制、配伍比例、制備工藝等進行了嚴格要求。由于經典名方配方多樣，且成分復雜，建立經典名方的質量標準，將經典名方中有效成分量化，更有利保證傳統古方的質量及療效[2-4]。課題組前期對藥材基原考證、飲片炮制、劑量等進行了大量考證，最終確定了芍藥甘草湯的處方量、加水量等關鍵工藝參數，為芍藥甘草湯制備工藝研究提供了依據。通過對芍藥甘草湯的藥理作用、臨床研究、質量控制等文獻研究確定其主要活性成分，并建立相應的質量標準。目前對于芍藥甘草湯的質量研究集中于指紋圖譜的建立及有效成分的含量測定[5-6]。張保國等[7]研究發現芍藥甘草湯具有抗炎、鎮痛、解痙等藥理作用，為芍藥甘草湯指標成分的選擇提供了理論依據。本研究以芍藥甘草湯煎液出膏率，各指標成分的轉移率等為指標對芍藥甘草湯物質基準的制備進行工藝研究；并對芍藥甘草湯中穩定且與功效相關的成分建立合理質量控制標準，建立相應的特征圖譜用以控制不同批次凍干粉的穩定性，為芍藥甘草湯的關鍵質量屬性提供參考，為后續制劑制備工藝及質量控制等提供參考。

1 材料

高效液相色譜儀，LC-2030，日本島津公司。芍藥苷對照品(110736-201943)、甘草對照品(111610-201607)、甘草酸銨對照品(110731-201720)購自于中國食品藥品檢定研究院。水為純化水。

芍藥甘草湯飲片均購自于3個產地，產地信息見表1。白芍為毛蔑科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。所用藥材均經過濟南市藥品檢驗所宋希貴主任進行鑒定，均符合要求。芍藥甘草湯所用飲片按照2020年版《中國藥典》芍藥及甘草項下含量測定方法進行檢查，均符合要求。

表1 15批凍干粉中各飲片的產地信息

2 方法與結果

2.1 物質基準的制備

芍藥55 g，炒甘草55 g，置2 L砂鍋中，加水600 mL，蓋蓋，浸泡30 min，用電陶爐作為熱源，先武火(1 800 W)加熱至沸，后文火(600 W)保持微沸煎至300 mL，趁熱濾過(150目)，濾液減壓濃縮(50 ℃，-0.1 MPa)至50 mL，預凍至結冰，冷凍干燥，研細，裝袋，即得。

2.2 對照品溶液及供試樣品的制備

2.2.1 對照品溶液制備 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.3 mg的溶液，即得。取甘草苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL分別含甘草苷20 μg、甘草酸銨200 μg的溶液，即得(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.020 7)。

2.2.2 煎液供試品溶液的制備 精密量取芍藥甘草湯煎液3 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，4 000 r/min離心5 min，濾過，取續濾液，作為供試樣品。

2.2.3 濃縮液試品溶液的制備 精密量取煎煮液1.7 mL，置50 mL量瓶中，加70%甲醇約45 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得煎煮液供試品溶液。精密量取濃縮液0.2 mL，置50 mL量瓶中，加70%甲醇約45 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得濃縮液供試品溶液。

2.2.4 干燥粉末供試品溶液的制備 取芍藥甘草湯干粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.05%磷酸溶液為流動相B，按表2中的規定進行梯度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為237 nm。

表2 含量測定梯度洗脫

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.4 煎煮工藝的研究

2.4.1 粉碎粒度的考察 分別取芍藥、炒甘草4目、10目粗顆粒及飲片，按比例稱取置砂鍋中，加水600 mL，蓋蓋，浸泡30 min，然后置電陶爐上，武火煎煮至沸騰，改用文火保持微沸，煎至300 mL，趁熱濾過(150目)。按上述供試樣品方法制備樣品進樣，采用綜合評分法對考察指標進行賦分，篩選芍藥苷草湯煎煮最佳粒度[8]。計算公式為：綜合得分=0.1×X1/X1max+0.1×X2/X2max+0.1×X3/X3max+0.1×Y/Ymax (X1～X3分別為芍藥苷、甘草苷、甘草酸，Y為出膏率)。結果見表3，綜合評分最高的為4目篩，故選擇過4目篩的粗顆粒。

表3 飲片粒度考察結果

2.4.2 浸泡時間考察 取4目粗顆粒2份，分別置2個2 L砂鍋中，加水600 mL，蓋蓋，分別不浸泡、浸泡30 min，然后置電陶爐上加熱，武火煎煮至沸騰，改用文火保持微沸，煎至300 mL，趁熱濾過(150目)。按上述供試樣品方法制備樣品進樣，通過綜合評分法進行優選。實驗結果見表4，綜合評分最高的為浸泡30 min，故在煎煮前需先浸泡30 min。

表4 浸泡時間考察結果

2.4.3 煎器考察 取4目粗顆粒3份，分別置2 L砂鍋，2 L不銹鋼鍋，2 L燒杯中，加水600 mL，蓋蓋，分別浸泡30 min，然后置電陶爐上加熱，武火煎煮至沸騰，改用文火保持微沸，煎至300 mL，趁熱濾過(150目)。按上述供試樣品方法制備樣品進樣，通過綜合評分法進行優選。結果見表5，綜合評分最高為砂鍋，且古代煎藥多采用砂鍋，現代煎藥也首推砂鍋，砂鍋的化學性質穩定，受熱均勻，能均衡而持久地把外界熱能傳遞給內部原料，相對平衡的環境溫度，有利于水分子與藥物的相互滲透，適用于小火慢熬。故煎器選用砂鍋最為合理[9-10]。

表5 煎器考察結果

2.4.4 加熱方式考察 取4目粗顆粒4份，分別4個置2 L砂鍋中，加水600 mL，蓋蓋，分別浸泡30 min，然后分別置電陶爐、天然氣爐，電阻爐，電磁爐上，武火煎煮至沸騰，改用文火保持微沸，煎至300 mL，趁熱濾過(150目)。按上述供試樣品方法制備樣品進樣，通過綜合評分法進行優選。結果見表6，綜合評分最高的為電陶爐。在現代煎煮過程中電陶爐的可控性、安全性更高，因此后續的試驗將采用電陶爐[11]。

2.4.5 是否加蓋考察[12]取4目粗顆粒2份，分別2個置2 L砂鍋中，加水600 mL，分別浸泡30 min，然后置電陶爐，一份加蓋煎煮，一份不加蓋煎煮，武火煎煮至沸騰，改用文火保持微沸，煎至300 mL，趁熱濾過(150目)。按上述供試樣品方法制備樣品進樣，通過綜合評分法進行優選。結果見表7，綜合得分最高的是加蓋煎煮。加蓋更有利于保存氣味，煎煮時長適當，出膏率更高，因此應當選擇加蓋煎煮。

表7 是否加蓋考察結果

2.4.6 濾過工藝考察 采用自然過濾，不加壓。擬以濾液得膏率為指標，對比100目篩網、150目篩網、200目篩網的濾過效果。

取6份煎煮液，每2份分別趁熱通過同規格濾材，測定濾液的得膏率結果見表8。從結果得知，不同目數的篩網，濾過速度和效果不同，100目篩耗時最短，濾速最快，出膏率也最高，藥物殘渣濾過而影響煎液質量；200目篩耗時最長，濾速最慢，出膏率相應最低，而且截留物增多。故選擇150目篩濾過。

表8 濾材考察

2.5 濃縮、冷凍干燥工藝

2.5.1 濃縮溫度考察 按優選工藝制備芍藥甘草湯的物質基準，5份溶液。按照上述方法進行供試樣品溶液的制備，按“2.3”項下色譜條件進行檢測分析。結果見表9，由結果可知45～60 ℃均能實現濃縮，隨著濃縮溫度的提高，濃縮耗時逐漸減少；4個濃縮溫度下所得濃縮液的顏色一致；3個指標成分的轉移率，50 ℃均最高，其他溫度稍低。綜合考慮，最優濃縮溫度為50 ℃。

表9 濃縮溫度考察

2.5.2 干燥工藝考察 按優選工藝制備芍藥甘草湯的物質基準，2份溶液。濃縮至50 mL，分別進行冷凍干燥、減壓干燥。按照“2.2”項下干燥粉末供試樣品的方法制備樣品，按照“2.3”項下色譜條件進行檢測分析。比較2種干燥方式對有效成分的保留情況，結果見表10。由數據可知，真空干燥干燥時間較冷凍干燥明顯長，且真空干燥對有效成分的保留較差，故芍藥甘草湯物質基準的干燥工藝優選為冷凍干燥。

表10 干燥工藝考察

2.6 芍藥甘草湯物質基準的制備工藝

在遵循古籍原文的基礎上，通過綜合評分優選芍藥甘草湯的最佳煎煮工藝：芍藥、炒甘草粉碎過4目篩，按比例稱取置于2 L砂鍋中，加水600 mL，蓋蓋，浸泡30 min，于電陶爐上加熱，武火煎煮至沸騰，改用文火保持微沸，煎至300 mL，趁熱濾過(過150目篩)。濾液減壓濃縮(50 ℃，-0.1 MPa)至50 mL，預凍至結冰，冷凍干燥，研細，裝袋，即得。

2.7 多批次物質基準的制備及質量標準的建立

采用隨機數字法制備15批物質基準，通過有效成分的含量及特征圖譜建立芍藥甘草湯物質基準的質量標準。

2.7.1 指標成分的含量范圍 按“2.2”項下凍干粉方法制備供試樣品，“2.3”項下色譜條件進行檢測分析。所得含量以(1±30%)平均值為限度，建立芍藥甘草湯各指標成分的限度范圍，結果見表11。最終確定芍藥甘草湯中芍藥苷的質量分數范圍為28.4～52.6 mg/g，甘草苷的質量分數范圍為7.7～14.1 mg/g，甘草酸的質量分數范圍為20.6～38.2 mg/g。

表11 指標成分對比結果

2.7.2 多批物質基準的特征圖譜 (1)供試樣品的制備：取芍藥甘草湯凍干粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

(2)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0.05%磷酸溶液為流動相B，檢測波長為237 nm。理論板數按芍藥苷峰計算應不低于5 000。梯度洗脫如下表12。

表12 梯度洗脫

(3)特征圖譜的建立：取15批凍干粉，制備供試樣品，進樣測定，記錄色譜圖，供試品色譜中應呈現9個與對照特征圖譜相對應的色譜圖；統計特征峰的保留時間及相對保留時間(見表13、表14)，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012)”將圖譜疊放，見圖1。

圖中S1～S15代表15批凍干粉，生成的對照特征圖譜見圖2。 供試品特征圖譜中應呈現9個特征峰，與參照物峰相應的峰為S 峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，應在規定值的±10%之內，保留時間規定值為：0.15(峰1)、0.20(峰2)、0.24(峰3)、0.27(峰4)、0.38(峰5)、0.57(峰6)、0.64(峰7)、0.82(峰8)、1.00 [峰9(S)]。

表13 15批凍干粉特征圖譜特征峰保留時間

表14 15批凍干粉特征圖譜特征峰相對保留時間

圖1 15批凍干粉特征圖譜

注：峰3：芍藥苷；峰5：甘草苷；峰9：甘草酸。

3 討論

3.1 加水量及劑量分析

《傷寒論》有云：“芍藥、甘草炙，各四兩，上 二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分溫再服。”解釋了芍藥甘草湯詳細的煎煮方法。經考證漢代一兩為13.75 g，一升為200 mL[13-14]。

3.2 粒度分析

芍藥甘草湯出自漢代《傷寒論》，主要是受生產條件及社會發展情況的影響，所記載的飲片炮制主要為“咀”。部分醫家從字面意思將其誤解為“咀嚼”，從類人猿就懂得使用石塊等工具破碎堅果來看，古人沒有必要用口嚼來破碎藥材。后經考證，“咀”是“父且”的通假字，應為切割之意，《醫心方·卷第一》引葛洪《葛氏方》：“咀者，皆應細切。”切的過程中，會產生細粒，所以本實驗考察4、10目的細粒煎煮情況[15-16]。

3.3 制備工藝分析

“遵古”是經典名方研究開發遵循的主要原則，本實驗前期經過嚴格詳細的考證，確定了芍藥甘草湯的劑量、加水量、炮制工藝等參數。并采用現代分析技術與傳統藥鍋煎煮方式相結合的方式優選最佳煎煮工藝，確定了藥材的粉碎粒度、煎煮容器、加熱方式、浸泡時間等工藝參數，其中粉碎粒度、加熱方式對成分的煎出率影響較大。

濃縮參數選擇的原則是最小程度破壞成分，且兼顧濃縮效率。減壓濃縮具有溫度低、效率高的特點，為制藥工業普遍采用，本濃縮采用減壓濃縮，不考慮常壓濃縮。冷凍干燥是在低溫、低壓下進行，與其他干燥方法相比，物料的物理結構和分子結構變化極小，其組織結構和外觀形態被較好地保存，而且能有效抑制熱敏性物質發生生物、化學或物理變化，較好地保存了活性物質。使干燥物質最大程度保持同煎煮液的質量一致性。

3.4 含量測定結果及特征圖譜分析

含量測定是從個別指標上對凍干粉進行質量控制，而特征圖譜的建立，對于從整體上對凍干粉進行質量控制有重要意義。

本研究對15批芍藥甘草湯的物質基準進行特征圖譜分析，標定了其中3個峰，并通過含量測定對標定的3種成分進行含量測定，所用方法具有合理性、可行性、穩定性，能夠較好地反映芍藥甘草湯凍干粉的物質群及質量，為芍藥甘草湯制劑研究奠定了基礎。