片姜黃飲片標準湯劑質量標準研究

王曉亞，馬智玲，陳敬然，張志強，沈建梅

(北京康仁堂藥業有限公司 中藥配方顆粒關鍵技術國家地方聯合工程研究中心 北京市中藥配方顆粒工程技術研究中心，北京 101301)

片姜黃為姜科植物溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chenet C.Ling的干燥根莖。味辛、苦，性溫，具破血行氣、通經止痛之功效[1]。臨床上常用于治療類風濕關節炎、骨關節炎導致的關節疼痛等[2]。片姜黃主要化學成分為倍半萜類、單萜類、姜黃素類化合物[3-5]。現代藥理研究表明其具有抗氧化、抗炎鎮痛、抗血栓凝血、抗腫瘤等作用[6]，其藥理作用主要與其含有的倍半萜類化合物密切相關。

目前，對于片姜黃含量測定及特征圖譜方面的質量控制研究較少，部分學者采用HPLC對片姜黃藥材及飲片特征圖譜方法進行了建構，多選用吉馬酮為指標成分[7-8]，但吉馬酮極性較小，水溶性較差，在標準湯劑中幾乎不溶出，將其作為片姜黃配方顆粒質量指標有待商榷。莪術烯醇具有止痛[9]及抑制肝癌細胞、子宮內膜癌細胞生長的藥理作用[10]，因此，本研究選用含量較高的藥效成分莪術烯醇作為片姜黃標準湯劑的質量評價指標成分，結合特征圖譜進行整體質量控制，判斷更加準確、客觀，符合臨床用藥需求，且為相關藥物研發提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC?H-Class超高效液相色譜儀(沃特世科技有限公司)，Empower色譜工作站，ME104E電子天平(梅特勒·托利多)，BSA124S電子天平(賽多利斯)，JY2002電子天平(梅特勒·托利多)，KQ-500DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電子恒溫水浴鍋DZKW-4(北京中興偉業儀器有限公司)。

1.2 試藥及試劑

片姜黃對照藥材(批號：121006-201404)，中國食品藥品檢定研究院；莪術烯醇對照品(批號：E-003-181612)，成都瑞芬思生物科技有限公司；18批片姜黃飲片由北京康仁堂藥業有限公司提供，經北京康仁堂藥業有限公司質量檢測中心鑒定為姜科植物溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chenet C.Ling的干燥根莖，經檢驗均符合藥典規定，樣品來源見表1。本試驗根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》制備18批片姜黃標準湯劑。乙腈、磷酸(Fisher Chemical)為色譜純，甲醇、乙醇為分析純，水為屈臣氏純化水。

2 方法與結果

2.1 片姜黃標準湯劑制備

取片姜黃飲片，一煎加入飲片量8倍水，浸泡30 min，武火(500 W)煮沸后，文火保持微沸30 min，趁熱過濾，迅速冷卻，備用；二煎加飲片量6倍水，武火煮沸后，文火保持微沸20 min，趁熱過濾，迅速冷卻備用；合并濾液，50 ℃減壓濃縮至料液比約為1∶1(相對密度為1.05～1.10(50 ℃))，冷凍干燥，即得。

表1 片姜黃飲片的來源信息

2.2 莪術烯醇含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITYUPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～8 min，5%→20%A；8～20 min，20%→33%A；20～28 min，33%→50%A；28～33 min，50%A；33～38 min，50%→80%A；38～40 min，80%→5%A)；檢測波長：260 nm；柱溫：40 ℃；流速：0.40 mL·min-1；進樣體積：1 μL。色譜見圖1。

圖1 片姜黃標準湯劑與莪術烯醇對照品的對比圖譜

2.2.2 對照品溶液制備 取莪術烯醇對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取片姜黃標準湯劑凍干粉適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)40 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 方法學考察 (1)線性關系考察。取莪術烯醇對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含莪術烯醇219.010 μg的對照品溶液，作為線性1；精密吸取對照品溶液5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，作為線性2；精密吸取線性2溶液5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，作為線性3；重復上述操作，依次作為線性4、線性5、線性6。精密吸取上述續濾液1 μL，注入超高效液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定莪術烯醇色譜峰峰面積，以莪術烯醇色譜峰的峰面積為縱坐標，莪術烯醇的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求得莪術烯醇的回歸方程為y=4 542.002 5x+1 445.537 3，R=1.000 0，其線性范圍為6.844 μg·mL-1～219.010 μg·mL-1。

(2)重復性試驗。取同一供試品(190617-611930-02)，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算得莪術烯醇的平均含量為1.521%，RSD為0.3%，表明該方法重復性良好。

(3)中間精密度試驗。不同分析人員于不同時間采用不同儀器(Waters UPLC H-Class液相色譜儀(TUV檢測器))進行中間精密度試驗。取6份供試品溶液，測定莪術烯醇的含量。結果中間精密度試驗所測得的莪術烯醇平均含量為1.510%，RSD值為0.7%，重復性試驗檢測結果的RSD為0.5%，符合中間精密度要求。

(4)穩定性試驗。取同一供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣測定，記錄莪術烯醇峰峰面積的變化情況，24 h內莪術烯醇的峰面積RSD值為0.5%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

(5)加樣回收率試驗。取莪術烯醇對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL含有61.81 μg的對照品溶液。取已知含量的供試品(190617-611930-02)6份，每份約0.1 g，精密稱定，精密加入對照品溶液25 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定莪術烯醇的含量，并計算回收率。結果表明測得回收率范圍為94.97%～96.28%，平均回收率為95.6%，RSD值為0.5%，表明該方法準確度良好。

2.2.5 樣品含量測定 取18批片姜黃標準湯劑凍干粉，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定莪術烯醇含量。結果見表2。

表2 出膏率及莪術烯醇轉移率測定結果 (%)

2.3 特征圖譜的建立及分析

2.3.1 色譜條件 同“2.2.1”項下色譜條件，對片姜黃標準湯劑凍干粉供試品溶液進行3D全波長掃描，結果顯示在240 nm處，圖譜中色譜信息豐富，因此選用240 nm作為特征圖譜檢測波長。

2.3.2 參照物溶液制備 取片姜黃對照藥材約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)40 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得，作為對照藥材參照物溶液。另取“2.2.2”項下對照品溶液，作為對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 同“2.2.3”項下供試品溶液制備方法。

2.3.4 方法學考察 (1)重復性試驗。取6份供試品溶液，獲得其特征圖譜，以莪術烯醇峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結果表明，各特征峰的相對保留時間RSD在0.0%～0.1%范圍內，相對峰面積的RSD在0.0%～2.4%范圍內，表明該特征圖譜方法重復性較好。

(2)中間精密度試驗。采用Waters UPLC H-Class(TUV檢測器)，取供試品溶液，獲得其特征圖譜，以莪術烯醇峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結果顯示采用Waters UPLC H-Class(TUV檢測器)獲得的特征圖譜中，各特征峰的相對保留時間一致，相對峰面積的RSD值在0.0%～0.9%范圍內。不同儀器間各特征峰相對保留時間RSD值在0.0%～1.0%范圍內，相對峰面積RSD值在0.0%～6.9%范圍內，表明中間精密度良好。

(3)穩定性試驗。取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h按上述確定的方法進樣測定，獲得其特征圖譜，以莪術烯醇峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結果表明，各特征峰相對保留時間的RSD值在0.0%～0.1%范圍內，相對峰面積的RSD值在0.0%～1.1%范圍內，表明供試品溶液中特征成分在24 h內穩定性較好。

2.3.5 特征圖譜的建立與相關性分析 分別制備18批片姜黃飲片標準湯劑的供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，將所得數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)》軟件[11]，采用多點校正將色譜峰自動匹配，中位數法計算得出樣品特征圖譜的共有模式，共確定4個共有峰，并與對照藥材參照物色譜峰中的4個特征峰相對應，其中，峰3與莪術烯醇對照品參照物峰保留時間一致，見圖2、圖3、圖4。以峰3(莪術烯醇)為S峰，計算各特征峰的相對保留時間。相對保留時間的規定值為0.28(峰1)、0.76(峰2)、1.25(峰4)。片姜黃標準湯劑4個特征峰在飲片中均能得到追蹤，表明片姜黃標準湯劑與飲片化學成分基本一致，見圖5。

3 討論

參照《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》和《醫療機構中藥煎藥室管理規范》，片姜黃為根莖入藥，當加入飲片量8倍的水量時，即可符合《醫療機構中藥煎藥室管理規范》中“煎煮開始時的用水量一般浸過藥面2～5 cm”的要求，結合吸水率考察結果，確定片姜黃標準湯劑的煎煮工藝條件為：浸泡30 min，煎煮2次，一煎加入飲片量8倍水，煎煮30 min，二煎加入飲片量6倍水，煎煮20 min。

圖2 18批片姜黃標準湯劑色譜

圖3 片姜黃標準湯劑對照圖譜及共有峰標識

圖4 片姜黃標準湯劑與參照物對比圖譜

圖5 片姜黃飲片與片姜黃標準湯劑共有峰模式標準圖譜對比

本試驗對提取溶劑、提取濃度、提取方式及提取時間進行了供試品溶液制備考察。分別以水、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇作為提取溶劑，結果表明70%甲醇提取效果最佳；選擇0.1 g·25 mL-1、0.2 g·25 mL-1、0.4 g·25 mL-1、0.8 g·25 mL-1進行提取濃度考察，結果顯示濃度為0.2 g·25 mL-1可提取完全且峰面積適中；選擇超聲20、40、60 min及回流40 min進行提取方式及時間考察，結果表明不同提取條件下所得結果差異不大，為確保供試品均可提取完全，且考慮到操作的簡便性，故選擇超聲處理40 min。

本試驗基于UPLC采用同一梯度洗脫程序于不同檢測波長條件下，建立了片姜黃標準湯劑的含量測定方法及特征圖譜方法，方法學考察均符合要求，表明該方法穩定可行、測定結果準確可靠，特征圖譜結合莪術烯醇定量的評價方法可較全面地反映片姜黃標準湯劑的內在質量，為片姜黃配方顆粒的質量控制及評價提供參考。

將片姜黃中提取的揮發油進樣對比發現，片姜黃標準湯劑特征圖譜中的4號峰為揮發油成分，由于其水溶性差，且提取、濃縮等過程中會造成揮發油損失，故轉移率較低。因此，片姜黃配方顆粒需采用先提取收集揮發油，再將揮發油包合物與濃縮液混合后干燥的方式進行制備，以實現物質傳遞，使得片姜黃配方顆粒的主要成分能夠與標準湯劑保持一致。