肉蓯蓉美白霜處方優(yōu)選及質(zhì)量評(píng)價(jià)

吳亞男，于英杰，耿宏俠，張新悅，王宇佳，嚴(yán)德康，郭睿博，李學(xué)濤

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

膚色與多種生物色素的存在有關(guān)，這些生物色素有助于抵御太陽(yáng)輻射，但決定膚色的最重要色素是黑色素[1]。黑色素在黑色素細(xì)胞中產(chǎn)生，該細(xì)胞中有一種溶酶體系細(xì)胞器，稱(chēng)為黑素小體，用來(lái)合成和儲(chǔ)存黑色素[2]。黑色素的合成由L-酪氨酸啟動(dòng)，在酪氨酸酶的催化作用下經(jīng)過(guò)多巴色素、多巴醌及多巴等一系列復(fù)雜的過(guò)程后生成黑色素。其中5，6-二羥基吲哚(5，6-dihydroxyindole，DHI)和5，6-二羥基吲哚-2-羧酸(5，6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid，DHICA)的含量比值決定了膚色由黑色到棕色的變化[3-4]。目前市場(chǎng)中的美白化妝品大多數(shù)均以酪氨酸酶為靶點(diǎn)，通過(guò)控制酪氨酸酶活性，從而降低黑色素的產(chǎn)生，以達(dá)到美白作用[5]。常用的皮膚美白添加劑種類(lèi)有曲酸及其衍生物、果酸、維生素C等，但這些添加劑均存在一些不良反應(yīng)。

肉蓯蓉是一種傳統(tǒng)中藥，自古以來(lái)主要用于治療男科疾病。其主要活性成分為苯乙醇苷[6]，在現(xiàn)代研究中，肉蓯蓉提取物包括改善性功能、抗衰老、抗氧化[7]、提高學(xué)習(xí)記憶能力、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、抗缺血和肝保護(hù)等功能。此外，傳統(tǒng)中藥的提取物作為產(chǎn)品添加劑與現(xiàn)代美白產(chǎn)品中的化學(xué)添加劑相比，中藥提取物具有皮膚親和力好、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，苯乙醇苷可顯著下調(diào)酪氨酸酶的活性[8]。因此，本研究以肉蓯蓉作為主要成分，制備美白霜，并對(duì)其進(jìn)行處方優(yōu)選及質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期為開(kāi)發(fā)肉蓯蓉中的美白成分提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

十八醇；單硬脂酸甘油酯；PEG100硬脂酸酯；鯨蠟硬脂醇；乳木果脂；合成角鯊?fù)椋槐迹煌聹?0；司盤(pán)60；甘油；卡波姆U30(均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司)；肉蓯蓉(產(chǎn)地內(nèi)蒙古，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為正品)；毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：111530-201007，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；氯仿、正丁醇、甲醇、甲酸、乙腈、硫酸、無(wú)水乙醇、磷酸均為分析純?cè)噭疄榧儍羲?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

FA1004型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械公司醫(yī)療器械五廠(chǎng))；SG3300H型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器公司)；硅膠預(yù)制板G(批號(hào)：20110905，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；C18色譜柱(月旭科技股份有限公司)。

2 方法與結(jié)論

2.1 美白霜制備

2.1.1 美白霜配方 十八醇0.3 g，單硬脂酸甘油酯0.5 g，PEG100硬脂酸酯0.25 g，鯨蠟硬脂醇0.1 g，乳木果脂0.75 g，合成角鯊?fù)?.25 g，司盤(pán)60 0.25 g，卡波姆U30 0.09 g，肉蓯蓉提取物0.5 g，甘油2.0 g，丙二醇1.25 g，吐溫60 1.0 g，三乙醇胺0.07 g。

2.1.2 美白霜制法 將十八醇、單硬脂酸甘油酯、PEG100硬脂酸酯、鯨蠟硬脂醇、乳木果脂、合成角鯊?fù)椤⑺颈P(pán)60置水浴鍋上80 ℃加熱熔融并混合均勻作為油相，卡波姆U30加水置水浴鍋上80 ℃加熱溶脹并溶解，加入肉蓯蓉提取物，再加入甘油、丙二醇、吐溫60并混合均勻作為水相，油相加入水相中，不斷攪拌并乳化，并加入三乙醇胺攪拌均勻，放冷，即得肉蓯蓉美白霜。

2.2 美白霜處方優(yōu)選

選用正交試驗(yàn)篩選肉蓯蓉美白霜的最優(yōu)處方。根據(jù)美白霜的細(xì)膩度、光澤度、黏度、保濕度等方面進(jìn)行綜合評(píng)分，取其平均值，依據(jù)結(jié)果選出美白霜的最優(yōu)處方。正交因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交因素水平

由表2可確定，美白霜的最優(yōu)處方為A2B1C2D3，即十八醇0.3 g，吐溫60 1.0 g，司盤(pán)60 0.25 g，卡波姆U30 0.09 g。由表3可確定，對(duì)美白霜影響最大的因素為卡波姆U30，具有顯著性差異。

表2 直觀(guān)分析

表3 方差分析

2.3 理化性質(zhì)檢測(cè)

通過(guò)觀(guān)察肉蓯蓉美白霜的性狀、細(xì)膩度，測(cè)定其酸堿度，并進(jìn)行離心、低溫和穩(wěn)定性測(cè)試。將制備的樣品置于-20 ℃條件下放置1 d，觀(guān)察是否有分層、顆粒析出的現(xiàn)象[9]。在室溫下連續(xù)放置30 d，觀(guān)察其是否穩(wěn)定，有無(wú)分層、顏色變化等現(xiàn)象。

按照“2.1.2”的方法制得的肉蓯蓉美白霜為棕色霜?jiǎng)庥^(guān)良好、細(xì)膩柔滑，在皮膚上涂抹無(wú)油膩感。測(cè)得pH為(6.90±0.05)，符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求，且通過(guò)觀(guān)察離心后樣品未出現(xiàn)油水分層現(xiàn)象。在-20 ℃放置1 d與室溫條件下連續(xù)放置30 d均未出現(xiàn)分層、顏色變化等現(xiàn)象，制得的肉蓯蓉美白霜表現(xiàn)出了較好的穩(wěn)定性。

2.4 薄層色譜鑒別

精密稱(chēng)取肉蓯蓉提取物1 g，加適量甲醇，于超聲波清洗器中超聲15 min，過(guò)濾后，蒸干水分至近干狀態(tài)，甲醇溶解，即得對(duì)照藥材溶液。取空白基質(zhì)、肉蓯蓉美白霜各0.5 g，加入甲醇，超聲溶解，離心，取上清液，分別作為陰性溶液和供試品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一薄層板上，以氯仿6∶正丁醇1∶甲醇2∶甲酸2的比例配置展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)[10]，取出后晾干，噴以10%的硫酸乙醇，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)清晰。由圖1可知，肉蓯蓉美白霜的薄層色譜斑點(diǎn)清晰，專(zhuān)屬性強(qiáng)，空白基質(zhì)無(wú)干擾。

2.5 毛蕊花糖苷含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件[11]色譜柱為C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.5.2 溶液制備 ①供試品溶液制備。精密稱(chēng)取制得的肉蓯蓉美白霜0.5 g，加甲醇適量，超聲溶解15 min(40 kHz)，過(guò)濾后于10 mL容量瓶中定容，即得供試品溶液。②對(duì)照品溶液制備。精密稱(chēng)取毛蕊花糖苷對(duì)照品4.13 mg，置100 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。③陰性溶液制備。精密稱(chēng)取制得的空白基質(zhì)0.5 g，加甲醇適量，超聲溶解，過(guò)濾后10 mL容量瓶中定容，即得陰性溶液。以上溶液均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)。

注：1.對(duì)照藥材；2.空白基質(zhì)；3、4、5肉蓯蓉美白霜。

2.5.3 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 分別取供試品、對(duì)照品、陰性溶液按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。供試品與對(duì)照品中毛蕊花糖苷出峰時(shí)間相近，陰性溶液未見(jiàn)該峰，說(shuō)明專(zhuān)屬性良好，陰性溶液對(duì)其無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

2.5.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 吸取毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液，制成6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，即得線(xiàn)性回歸方程y=28 483x+54 316(R2=0.999 4)，表明毛蕊花糖苷在6.25～200 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，即得毛蕊花糖苷的峰面積RSD為1.58%(n=6)，表明儀器精密度良好。

圖2 毛蕊花糖苷含量測(cè)定的HPLC

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，即得毛蕊花糖苷的峰面積RSD為1.81%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取于室溫下放置0、4、8、12、20、24 h的供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，即得毛蕊花糖苷的峰面積RSD為1.04%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取9份已知含量的供試品溶液，加入等量毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 毛蕊花糖苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.9 含量測(cè)定 精密稱(chēng)取肉蓯蓉美白霜9份，每份0.5 g，按“2.5.2 ①”方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 毛蕊花糖苷含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

3 討論

盡管許多酶參與了黑色素的生成過(guò)程，但酪氨酸酶和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1(Tyrosinase-related protein-1，TRP-1)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2(Tyrosinase-related protein-2，TRP-2)在黑色素合成中起著重要作用。具體來(lái)說(shuō)，酪氨酸酶在催化黑色素合成中起到限速作用，是黑色素合成抑制劑發(fā)展的最重要途徑。已知的黑色素沉著由超過(guò)125個(gè)不同的基因調(diào)控[12]。這些基因調(diào)控著黑色素細(xì)胞一些重要的生物學(xué)功能，如細(xì)胞分化以及調(diào)節(jié)色素沉著或黑色素生成。其中，小眼轉(zhuǎn)錄基因(Microphthamia transcription factor，MITF)是已知黑色素細(xì)胞發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子中最重要的成員[13]。MITF通過(guò)綁定TYR、TRP-1、TRP-2 三種基因表達(dá)的啟動(dòng)因子區(qū)域，從而調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄過(guò)程[14]。肉蓯蓉苯乙醇苷能夠降低黑色素含量，顯著抑制TYR、TRP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平，并能下調(diào)TYR、TRP-1和TRP-2的蛋白表達(dá)。此外，肉蓯蓉苯乙醇苷也可抑制MITFmRNA轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)MITF的蛋白表達(dá)[15]。

我國(guó)對(duì)美白化妝品的需求量逐年遞增，但目前大多數(shù)化妝品中的有效成分通常有有害成分，我國(guó)中藥資源豐富，且安全性高，因此，本研究采用肉蓯蓉為原料，制備美白霜。所制得的美白霜外觀(guān)良好、細(xì)膩柔滑、性質(zhì)穩(wěn)定，在皮膚上涂抹無(wú)油膩感，親膚力較強(qiáng)；對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明其穩(wěn)定性良好。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)具有方法科學(xué)、操作簡(jiǎn)便、效果顯著的優(yōu)點(diǎn)，因此，選用正交試驗(yàn)篩選肉蓯蓉美白霜的最優(yōu)處方，確定的最優(yōu)處方為十八醇0.3 g，吐溫60 1.0 g，司盤(pán)60 0.25 g，卡波姆U30 0.09 g。通過(guò)方差分析確定對(duì)美白霜影響最大的因素是卡波姆U30。利用高效液相色譜法測(cè)定毛蕊花糖苷含量簡(jiǎn)單可行、重現(xiàn)性好、精密度高、結(jié)果可靠，可用于測(cè)定肉蓯蓉美白霜中毛蕊花糖苷的含量。