淡竹葉標準湯劑UPLC特征圖譜研究

徐彤彤，林碧珊，劉 青，陳錦霞，肖炯昌，劉 勇，張文芳

(國藥集團廣東環球制藥有限公司，廣東 佛山 528303)

淡竹葉為禾本科植物淡竹葉LophatherumgracileBrongn.的干燥莖葉，一般在5-6月未開花前采割，曬干[1]。其主要化學成分包括黃酮類、三萜類、甾醇類、酚酸、氨基酸和糖類等[2-4]，具有清熱、瀉火、除煩的作用，是涼茶中經常會用到的一種藥材。目前，《中華人民共和國藥典》2020版(以下簡稱《中國藥典》)中僅規定了淡竹葉藥材總灰分和水分的限度，并沒有規定特征圖譜項，不能整體反映藥材的質量信息。中藥標準湯劑是以水為溶媒，在中醫藥理論的指導下，根據臨床標準化湯劑煎煮方式制得的單味藥水煎液。為了保證中藥配方顆粒使用的安全性、有效性，標準湯劑起到參照物的作用，是評價中藥配方顆粒是否與臨床湯劑一致的基準[5-6]。因此，為了對中藥配方顆粒進行全產業鏈質量控制，深入開展標準湯劑特征圖譜的研究非常必要。淡竹葉飲片的炮制方法是除去雜質后切段，本實驗將藥材切段，按照標準湯劑制備方法煎煮，與標準湯劑進行比較，建立淡竹葉藥材、標準湯劑UPLC 特征圖譜，為淡竹葉中藥配方顆粒的全過程控制提供參考[7-9]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

H-class UPLC高效液相色譜儀(PDA二極管陣列檢測器，Waters公司)；MS105DU和AL104型電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；M-MILLIPORE Synergy UV 型超純水制備儀(MILLIPORE公司)；KQ-500DE型超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

異葒草苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：11974-201401)、日當藥黃素對照品(成都德思特生物技術有限公司，批號：DST180202-050)；乙腈和磷酸為色譜純；無水乙醇為分析純；超純水由MILLIPORE Synergy UV純水儀制備。17批淡竹葉產地信息見表1，根據《中藥配方顆粒質量控制與標準指定技術要求(征求意見稿)》制備淡竹葉標準湯劑凍干粉。

表1 淡竹葉產地信息

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters CORTECS T3 (2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；乙腈為流動相A，0.1%磷酸水溶液為B，洗脫梯度：(0～2 min，10% A；2～3 min，10～16% A；3～7.5 min，16% A；7.5～16 min，16～52% A)；流速為0.25 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為350 nm；進樣體積為1 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 取異葒草苷對照品適量，精密稱定，加60%乙醇制成每1 mL含10 μg異葒草苷的對照品溶液。

取日當藥黃素對照品適量，精密稱定，加60%乙醇制成每1 mL含10 μg日當藥黃素對照品溶液。

2.2.2 淡竹葉藥材(飲片)供試品溶液制備 取淡竹葉藥材(飲片)細粉1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 淡竹葉標準湯劑供試品溶液制備 取相當于飲片1 g的淡竹葉凍干粉，精密稱定，置50 mL量瓶中，加60%乙醇適量使溶解，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)10 min，取出，放冷，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液1份，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以峰2異葒草苷為參照峰，各共有峰所得相對保留時間的RSD值均小于0.3%，相對峰面積RSD值均小于1.0%，結果表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以峰2異葒草苷為參照峰，各共有峰所得相對保留時間的RSD值均小于0.3%，相對峰面積RSD值均小于2.0%，結果表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液1份，按“2.1”項下色譜條件分別于0、4、8、12、16、20、24h進樣，以峰2異葒草苷為參照峰，各共有峰所得相對保留時間的RSD值均小于0.4%，相對峰面積的RSD值均小于1.0%，結果表明供試品溶液24 h內穩定。

2.4 特征圖譜的建立與分析

取17批淡竹葉藥材(飲片)、標準湯劑，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。

將數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”，以平均數法，選擇時間窗寬度為0.10，分別生成藥材(飲片)和標準湯劑的特征圖譜，并生成各自的對照特征圖譜，結果見圖1、圖2，并以對照特征圖譜為參照進行相似度評價。經對比分析確定淡竹葉標準湯劑有4個共有峰，發現淡竹葉藥材(飲片)特征圖譜與標準湯劑基本一致，有4個共有峰，分別與異葒草苷、日當藥黃素對照溶液色譜圖進行比對，確定峰2為異葒草苷、峰3為日當藥黃素，結果見圖3。生成的淡竹葉藥材(飲片)、標準湯劑對照特征圖譜，見圖4。在17批樣品圖譜中，異葒草苷峰為多批次中的共有峰，較穩定且分離度良好，因此確定異葒草苷為參照峰，分別計算淡竹葉藥材(飲片)及標準湯劑各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表2。

圖1 17批淡竹葉藥材(飲片)UPLC特征圖譜

圖2 17批淡竹葉標準湯劑UPLC特征圖譜

表2 淡竹葉藥材(飲片)、標準湯劑UPLC特征圖譜分析

圖3 淡竹葉標準湯劑供試品溶液與對照品溶液的UPLC色譜

2.5 相關性分析

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”，計算17批淡竹葉藥材(飲片)、標準湯劑相似度，結果見表3。淡竹葉標準湯劑的4個共有特征峰在淡竹葉藥材(飲片)中均有顯示，表明在經過水提、固液分離、濃縮、干燥后制得的標準湯劑中沒有新峰產生，也沒有共有峰丟失，表明在制備過程中可追溯。17批藥材(飲片)特征圖譜與生成對照特征圖譜相似度為0.876～0.996，標準湯劑特征圖譜與生成對照特征圖譜相似度為0.884～0.990，結果表明淡竹葉藥材(飲片)與標準湯劑的化學成分基本一致，整體具有相似性，以峰2異葒草苷峰為參照峰，分別計算淡竹葉藥材(飲片)和標準湯劑各共有峰的相對峰面積，結果發現相對峰面積值基本相符，各成分得到了有效的轉移[10-11]，但不同批次共有峰相對峰面積的標準偏差值波動較大，藥材(飲片)各共有峰相對峰面積的標準偏差大于39%，說明不同產地、不同批次藥材質量參差不齊，各成分峰面積相差較大，這可能與產地、氣候、運輸、貯存條件等因素有關。

表3 17批淡竹葉藥材(飲片)、標準湯劑相似度

圖4 淡竹葉藥材(飲片)(B)、標準湯劑(A)對照特征圖譜

2.6 特征圖譜的應用

淡竹葉在我國分布范圍廣泛，目前關于不同產地淡竹葉藥材鑒別的研究文獻較少，大多數研究都是通過性狀鑒別區分淡竹葉與混偽品。通過研究不同產地淡竹葉藥材特征圖譜發現，其中一批藥材按《中國藥典》檢驗合格，制備成淡竹葉水煎液后測定特征圖譜，發現峰4丟失，結果見圖5。表明此方法可用于淡竹葉與混偽品的鑒別，能從藥材源頭上得到控制。

圖5 淡竹葉與偽品色譜

3 討論

本實驗對梯度洗脫條件、檢測波長、色譜柱、柱溫、流速等系統適應性條件進行了考察，通過PAD檢測器對供試品色譜在200～400 nm波長范圍內進行光譜掃描，在350 nm波長下色譜圖基線平穩，色譜峰信息較豐富，故選擇350 nm作為該方法的檢測波長。通過對供試品溶液制備方法進行考察，分別考察了提取溶劑(甲醇、50%甲醇、30%乙醇、60%乙醇、水)、提取方式(回流、超聲)、提取時間(10 min、20 min、30 min)，結果表明在超聲提取10 min、60%乙醇為溶劑時提取效果最佳。

淡竹葉標準湯劑的特征圖譜與藥材(飲片)特征圖譜相似度較高，表明其化學成分基本一致，能夠充分反映出從藥材(飲片)到標準湯劑過程中化學成分可追溯。17批藥材(飲片)、標準湯劑均有4個共有峰，其特征圖譜相似度分別在0.876～0.996、0.884～0.990，化學成分相關性良好。傳統飲片的服用方式一般為水煎服，通過特征圖譜可以反映中藥飲片到標準湯劑的傳遞性。本研究建立的超高效液相色譜法，大幅縮短了分析時間，降低了成本，提高了效率，通過特征圖譜共有峰，可區分淡竹葉混偽品，也為其藥材質量標準的制定提供了依據，為淡竹葉中藥配方顆粒的全過程控制提供了方法。