鎮咳寧口服液質量標準提高研究*

許丁香，譚智艷，李仁瑋，齊 皓

（1. 湘南學院附屬醫院藥劑科，湖南 郴州 423000； 2. 湖南省郴州市食品藥品檢驗檢測中心生化藥理室，湖南 郴州 423600）

鎮咳寧口服液由桔梗、枳實、陳皮、遠志、白前、法半夏、紫菀、甘草、百部等14味中藥材組方，為湖南省郴州市安仁縣人民醫院院內制劑，臨床應用10余年，主要用于治療感冒引起的咳嗽。其現行質量標準主要是對桔梗、甘草、遠志3 種藥材及其中主要化學成分橙皮苷進行定性鑒別。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對制劑中枳實、百部2 種藥材進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定橙皮苷的含量，以期為鎮咳寧口服液質量標準的提高提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器、Chemstation 工作站（美國Agilent 公司）；XSE250DU 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；JA5003型電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；KQ3200DB型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

鎮咳寧口服液（湖南省郴州市安仁縣人民醫院，批號分別為20180907，20181109，20181212，規格為每支10 mL）；枳實對照藥材（批號120936-201606）、百部對照藥材（批號121221 - 201604）、橙皮苷對照品（批號110721 - 201818，含量96.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司）；甲醇、冰醋酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

枳實［1-2］：取樣品20 mL，加三氯甲烷40 mL，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz，下同）處理30 min，濾過，濾液蒸干后加無水乙醇1 mL 使溶解，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取枳實對照藥材1 g，加三氯甲烷20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干后加無水乙醇1 mL 使溶解，濾過，取續濾液，即得對照藥材溶液。按鎮咳寧口服液處方和工藝制備缺枳實的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》TLC法，吸取上述溶液各10 μL［3］，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯- 丙酮- 冰醋酸（15∶1∶0.5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 mm）下檢視［4］。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1。

1. 陰性對照品溶液 2. 對照藥材溶液 3-5. 供試品溶液圖1 枳實薄層色譜圖1.Negative reference solution 2.Reference medicinal material solution 3-5.Test solutionFig.1 TLC chromatograms of Aurantii Fructus Immaturus

百部［5］：取樣品30 mL，加氨水溶液調pH 至10，用三氯甲烷萃取2 次（每次25 mL），合并有機相，蒸干，加甲醇1 mL使溶解，即得供試品溶液。取百部對照藥材2 g，用氨水溶液充分潤濕，室溫下放置10 min，加三氯甲烷20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干后加甲醇1 mL使溶解，即得對照藥材溶液。按鎮咳寧口服液工藝處方制備缺百部的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》TLC法，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-甲醇（8∶5∶0.5，V/V/V）為展開劑，用飽和氨蒸氣預飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀稀溶液。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖2。

1. 對照藥材溶液 2-4. 供試品溶液 5. 陰性對照品溶液圖2 百部薄層色譜圖1.Reference medicinal material solution 2-4.Test solution 5.Negative reference solutionFig.2 TLC chromatograms of Stemonae Radix

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini-NX C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-冰醋酸（35∶61∶4，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：283 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL［6-8］。

2.2.2 溶液制備

取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含0.02 mg/mL橙皮苷的對照品溶液。精密量取樣品5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，超聲處理30 min后，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按鎮咳寧口服液工藝和處方制備缺枳實、陳皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2.2 項下3 種溶液各適量，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果陰性對照品溶液與對照品溶液色譜峰相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖3。

線性關系考察：分別精密吸取2.2.2項下對照品溶液2，4，8，16，32，64 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.997 3X+1.077 3（R2=1.000，n=6）。結果表明，橙皮苷進樣量在0.04 ～1.28 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2.2 項下對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。結果橙皮苷峰面積的RSD為0.50%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，10，22 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果橙皮苷峰面積的RSD為1.10%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置22 h內基本穩定。

1. 橙皮苷A. 對照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對照品溶液圖3 高效液相色譜圖1.HesperidinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

重復性試驗：取樣品（批號為20181212）適量，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，共6 份，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果橙皮苷峰面積的RSD為0.70%，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為20181212）5 mL，精密稱定，共6份，分別精密加入橙皮苷對照品溶液適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，平行3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果批號為20180907，20181109，20181212 的樣品中橙皮苷含量分別為0.274 1，0.274 9，0.273 5 mg/ mL，RSD分別為0.4%，0.8%，0.4%。

3 討論

本制劑現行質量標準主要為定性鑒別，未涉及定量內容。鎮咳寧口服液由14味中藥組方，現行標準可鑒別藥材數量過少，且缺少陰性對照試驗驗證。

TLC法在單味中藥、中成藥及中藥相關制劑的鑒定中應用廣泛，且操作簡單、準確度高。HPLC 法因其高壓、高效、高靈敏度等特點，成為中藥關鍵物質定量測定首選方法。因此，本研究中結合TLC 法及HPLC 法對鎮咳寧口服液進行質量標準研究。橙皮苷為二氫黃酮苷化合物，易溶于吡啶及氫氧化鈉溶液，微溶于甲醇，且吡啶屬2B類致癌物，氫氧化鈉不能應用于色譜，故選用甲醇。本研究中參考相關文獻和大量試驗研究對原TLC 法進行了驗證和修訂，解決了陰性干擾問題，并保證了試驗的可重復性［9-12］。此外，本研究中還建立了枳實和百部的TLC 鑒別方法，該方法具有良好的重復性和特異性。橙皮苷存在于陳皮和枳實中，故以該成分作為含量指標。在預試驗中考察了不同的流動相，結果以甲醇-水-冰醋酸（35∶61∶4，V/V/V）為流動相，分辨率最佳，無干擾，適用于橙皮苷的含量測定。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡單，精密度、穩定性、重復性均較好，可用于提高鎮咳寧口服液的質量標準。