實(shí)時(shí)熒光PCR在檢測(cè)雞精中雞源性成分中的應(yīng)用

陳欣　周正?！∫丁「渡颉⊥趵麆?/p>

摘要：為監(jiān)測(cè)雞精中雞源性成分情況，文中設(shè)計(jì)了一套特異性的探針和引物，使用實(shí)時(shí)熒光PCR，對(duì)市售的30種雞精樣品進(jìn)行雞源性檢測(cè)。其中，能檢測(cè)出雞源性成分的樣品28個(gè)，未能檢測(cè)出雞源性成分的樣品2個(gè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)的特異性探針和引物在給定的擴(kuò)增條件下可以在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出雞精中的雞源性成分，具有操作簡(jiǎn)便快捷，檢出靈敏度高，擴(kuò)增特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，方法可用于雞精中雞源性的檢測(cè)，為市場(chǎng)監(jiān)管部門開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光PCR;雞精;雞源性成分

Application of Real-time PCR in the Detection of Chicken-derived Components in Chicken Essence

CHEN Xin ZHOU Zheng-Hai YIN Lu FU Sha-Li WANG Li-Gang

Abstract：In order to monitor whether chicken essence contains chicken derived components， a set of specific probes and primers were designed. Real-time PCR was used to detect 30 kinds of chicken essence in the market. The results manifested that 28 chicken essences were found to have chicken derived components， and 2 chicken essences were not found to have chicken derived components. The designed probe and primer can specifically detect the chicken derived components in chicken essence in a short time. This method is simple， rapid， highly accurate and specific， which can provide a practical and effective method for the monitoring of chicken origin in chicken essence.

Key Words： Real-time PCR; Chicken essence seasoning; Chicken-derived ingredients

1前言

隨著人們對(duì)烹飪需求的提高，近幾年，我國(guó)固體調(diào)味品市場(chǎng)日漸增大，其中雞精更是受到了消費(fèi)者的廣泛喜愛(ài)。雞精的產(chǎn)量逐年增加，2019年的產(chǎn)量達(dá)到43.42萬(wàn)噸，其市場(chǎng)規(guī)模也在2019年達(dá)到44.95億元。根據(jù)我國(guó)商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10371-2003《雞精調(diào)味料》，雞精的原料是雞肉/雞骨的粉末或其濃縮抽提物、味精、食用鹽、呈味核苷酸二鈉及其輔料。雞精中是否有“雞”也成為消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)。

PCR技術(shù)是一種分子生物技術(shù)，與色譜法、化學(xué)方法等相比較，PCR技術(shù)因其特異性強(qiáng)，檢測(cè)時(shí)間較短，靈敏度高，已在檢測(cè)動(dòng)物源性成分中受到了廣泛應(yīng)用[1-4]。實(shí)時(shí)熒光PCR是利用對(duì)PCR反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品模板的定性分析[5]。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)雞精樣品進(jìn)行檢測(cè)，旨在了解市面上雞精中雞源性成分情況。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

2.1.1 雞精

本次實(shí)驗(yàn)中30個(gè)批次的雞精樣品（編號(hào)：1-30）均購(gòu)自商超、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等。雞骨、雞肉、豬肉和牛肉均購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

2.1.2 引物、探針的設(shè)計(jì)和合成

設(shè)計(jì)的引物和探針序列見(jiàn)表1。引物和探針均由深圳華大基因合成。

2.1.3 試劑

通用基因組DNA提取試劑盒（廠家：TaKaRa 貨號(hào)：9765），Premix Ex Taq（廠家：TaKaRa 貨號(hào)：RR390）。

2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)（廠家：瑞士羅氏公司 型號(hào)：LightCycler96），微量核算蛋白分析儀（廠家：Thermo 型號(hào)：NanoDrop ONEc），恒溫水浴鍋（廠家：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器 型號(hào)：DK-8D），高速冷凍離心機(jī)（廠家：Thermo 型號(hào)：Legend Micro21R）。

2.2 方法

2.2.1 雞精中DNA的提取

按DNA提取試劑盒的說(shuō)明書，對(duì)雞精樣品進(jìn)行DNA提取。取20mg～25mg的雞精，置于離心管中，加入10?L的RNA酶（10mg/mL），180?L的GL緩沖液和20?L的蛋白酶K，于56℃水浴溫浴約3小時(shí)。將上述裂解液12000rpm離心2min，取上清200?L，加入1：1的無(wú)水乙醇和GB緩沖液充分吸打混勻。將混勻的液體移至安置在收集管上的吸附柱中，離心兩分鐘后，倒掉濾液。接著用WA緩沖液和WB緩沖液分別進(jìn)行洗脫，并倒掉濾液。最后將洗脫后的吸附柱安置于新離心管上，用Elution Buffer（需提前預(yù)熱到65℃）洗脫DNA，得到雞精樣品的DNA。

2.2.2 雞骨、雞肉、牛肉和豬肉DNA的提取

按照DNA提取試劑盒的說(shuō)明書，對(duì)雞骨、雞肉、牛肉和豬肉進(jìn)行DNA提取。分別取20mg-25mg的雞骨、雞肉、牛肉和豬肉，將雞肉、豬肉和牛肉剪碎，雞骨用液氮研磨后，置于離心管中，加入10?L的RNA酶（10mg/mL），180?L的 GL緩沖液和20?L的蛋白酶K，于56℃水浴溫浴5小時(shí)。其他步驟同2.2.1 雞精中基因組DNA的提取。

2.2.3 熒光PCR檢測(cè)

反應(yīng)體系配制比例見(jiàn)表2。

向每個(gè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管中加入以上反應(yīng)混合液，轉(zhuǎn)移至樣品制備區(qū)。提取雞肉，雞骨中的DNA用于陽(yáng)性對(duì)照，提取豬肉和牛肉中的DNA作為陰性對(duì)照，等體積的去離子水用于空白對(duì)照。分別將制備好的模板DNA溶液加入裝有反應(yīng)混合液的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

擴(kuò)增條件見(jiàn)表3。

3 結(jié)果與分析

3.1 模板DNA質(zhì)量

將獲得的DNA提取液用微量核算蛋白分析儀測(cè)定。其OD260/280的值為1.8-2.0，能滿足實(shí)時(shí)熒光PCR的要求。

3.2 質(zhì)控

為防止出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，將豬肉和牛肉中提取的DNA作為陰性對(duì)照，雞肉和雞骨頭中提取的DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，等體積去離子水作為模板空白對(duì)照。對(duì)照組均設(shè)置2個(gè)重復(fù)，樣品組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。結(jié)果顯示，空白、陰性對(duì)照的2組重復(fù)均無(wú)FAM熒光信號(hào)檢出;陽(yáng)性對(duì)照2組重復(fù)均有FAM熒光信號(hào)檢出，Ct值均<30.0，呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

3.3 結(jié)果

經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)30個(gè)雞精樣品中，有28個(gè)雞精樣品檢測(cè)出雞源性成分，有2個(gè)雞精樣品未檢測(cè)出雞源性成分。根據(jù)每個(gè)雞精樣品的配料表中與雞源性相關(guān)的成分的標(biāo)識(shí)，未檢出雞源性的樣品分別標(biāo)識(shí)了食用雞油和雞肉香精，而檢出雞源性成分的樣品則標(biāo)識(shí)了雞肉粉、雞肉蛋白粉、雞肉等，見(jiàn)表4。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相比傳統(tǒng)PCR技術(shù)具有少污染、高通量、更便捷的優(yōu)點(diǎn)，在雞精中雞源性的檢測(cè)具有一定的優(yōu)勢(shì)。然而熒光PCR也有其局限性，容易受殘留的DNA提取試劑和加工原料的影響[6]，雞精中的成分復(fù)雜，對(duì)于熒光PCR的干擾因子也較多。本實(shí)驗(yàn)以豬肉和牛肉的DNA提取物作為陰性對(duì)照，雞肉和雞骨的DNA提取物作為陽(yáng)性對(duì)照，且陽(yáng)性對(duì)照均為陽(yáng)性，空白對(duì)照和陰性對(duì)照的結(jié)果均為陰性，說(shuō)明建立的實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)是具有可信度的。本實(shí)驗(yàn)對(duì)30個(gè)雞精樣品進(jìn)行雞源性檢測(cè)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出檢測(cè)的28個(gè)雞精樣品添加了含有雞源性成分的配料，且都檢出了雞源性成分。一個(gè)雞精樣品未添加雞源性成分配料，未檢測(cè)出雞源性成分。另一個(gè)雞精樣品雖然添加了食用雞油，但并未檢出雞源性成分。含有雞源性成分的配料必然會(huì)比僅添加香精的產(chǎn)品成本高，且現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)并未對(duì)雞精中雞源性檢測(cè)做出規(guī)定，勢(shì)必造成某些商家為了節(jié)約成本，欺騙消費(fèi)者。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于雞精中雞源性檢測(cè)的研究較少，本實(shí)驗(yàn)可為雞精質(zhì)量監(jiān)管提供可行的檢測(cè)鑒定參考。

參考文獻(xiàn)

[1]Saini M， Das D K， Dhara A， et al. Characterisation?of peacock （Pavo cristatus） mitochondrial?12S rRNA sequence and its use in differentiation?from closely related poultry species[J].British??Poultry Science， 2007， 48（2）：162-166.

[2]李婷婷，張桂蘭，趙杰，朱超，王之瑩，陳愛(ài)亮.肉及肉制品摻假鑒別技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2018，9（02）：409-415.

[3]陳曉宇，陸利霞，熊雄，等.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)鑒別流通環(huán)節(jié)的摻假牛肉及其制品[J].生物加工過(guò)程，2021，19（2）：214-226.

[4]Dooley J J， Paine K E， Garrett S D， et al. Detection?of meat species using TaqMan real-time PCR?assays[J].Meat Science，2004， 68（3）：431-438.

[5]周云龍.轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制與應(yīng)用[M].中國(guó)質(zhì)檢出版社，2014：51-52.

[6]程欣.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR方法鑒別食品中的鴨源性成分[D]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.