好的 氧化石墨烯液體創可貼對創面愈合的研究

韋曉?龔獲權?馮玉燕?吉忻

摘要：利用低濃度氧化石墨烯（GO）作為以PVA-124為成膜基質的新型液體創可貼的抑菌成分，測試最佳抑菌濃度以及對大鼠創面愈合VEGF表達及創面愈合的影響。研究表明GO含量為120 mg/mL抗金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌效果較佳。各組不同時間創面愈合率均無明顯差異（P>0.05），各組不同時間之間VEGF陽性占比比較無顯著差異P>0.05，氧化石墨烯對于創面愈合作用影響不大，對于創面VEGF表達沒有影響。

關鍵詞：氧化石墨烯;VEGF;液體創可貼

【中圖分類號】 R943 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）08--03

Abstract：Low-concentration graphene oxide （GO） was used as the antibacterial component of a new type of liquid band-aid with PVA-124 as film-forming matrix.Test optimal bacteriostatic concentrations and effects on VEGF expression and wound healing in rats.The results showed that the GO content of 120 mg/mL had a better effect on Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa.Graphene oxide has little effect on wound healing and no effect on VEGF expression in wound.

前言：

涂膜劑是一種涂抹于創面或患處后形成一層保護膜的外用液體制劑，基本原理是將藥物溶解或分散在含有成膜材料的溶劑中，液體創可貼是涂膜劑的一種，其主要是用于皮膚表面創傷，涂抹于創傷皮膚表面能快速形成完整而無氣泡、防水、防滲且具有一定的柔韌性和透氣性的保護薄膜，其能保護創面免受細菌的感染、異物入侵、避免與衣物的再擦傷等功能，雖然目前已經有大量用于皮膚創面的涂膜劑上市，相較于傳統的敷料定的優勢，但對于傷口感染防治效果欠佳，不利于傷口愈合。PVA[1] [2]是涂膜劑中常用的成膜材料，是唯一能夠被微生物降解的高分子材料，具有較佳的生物相容性。

氧化石墨烯是石墨烯的衍生物之一，結構與石墨烯基本相同，在單層碳原子結構的基面上含有豐富的含氧基團[3]。豐富含氧官能團的引入使得原來石墨烯所擁有的非常獨特優異的光、電、磁、等物理和化學性質大大降低，但增強了氧化石墨烯的反應活性和親水性，因此為其自身帶來了廣泛的應用前景。2010年中黃慶林[3]課題組首次提出氧化石墨烯抑菌作用，其抗菌原理仍未明確，Liwei Hui[4]提出鹽水中氧化石墨烯為200 μg/ mL時產生<1%的細菌存活率，從眾多報道中其可能存在的抗菌原理可簡單總結為物理破壞理論、氧化應激理論、磷脂分子抽提破壞理論三個方面[5]，基于GO良好的生物相容性，有研究表明高濃度氧化石墨烯會對哺乳動物細胞產生毒性，具有顯著遺傳毒性特性并導致嚴重的DNA損傷[6-10]，VEGF（血管生長內皮生長因子）在創面愈合早期能促進創面新生血管的形成為創面愈合提供營養物質[11-13]。

1儀器與試劑

1.1實驗儀器

XSR205DU型分析天平（Mettler-Toledo Gmbh）、TSJ-Ⅱ型脫水機（常州市中威電子儀器有限公司）、BMJ-Ⅲ型包埋（常州郊區中威電子儀器廠）、RM2016型切片機（上海徠卡儀器有限公司）、BA410型顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）、BMJ-A型冷凍臺（常州市中盛電子儀器有限公司）、PHY-Ⅲ型漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公）、DHG-9148A型干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）、A80400011型修復儀（Thermo Shandon Limited ）、HY-5型脫色搖床（上海程捷儀器設備有限公司）、XK80-A型漩渦混勻儀（江蘇新康醫療器械有限公司）、S1010E型掌上離心機（美國SCLOGEX）、超凈工作臺（上海博訊實業有限公司醫療設備廠SW-CJ-2F）、恒溫培養箱（天呈TS-100B）、YE3K176096型20-200 μl移液槍（大龍興創實驗儀器（北京）有限公司，）HWS-28型數顯恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）、

1.2試劑：

氧化石墨烯（蘇州碳豐科技）、PVA124（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190703）、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190605）、甘油（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130105）、LB瓊脂培養基（上海博微生物科技有限公司，批號：20200802）、80%苯扎氯銨（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10238825）、4%多聚甲醛通用型組織固定液（biosharp，批號：69120900）、氯化鈉注射液（貴州科倫藥業有限公司，批號：D21010705），CMCC（B）10104銅綠假單胞菌、ATCC25922大腸埃希氏菌、CMCC（B）26003金黃色葡萄球菌均購自上海魯微科技有限公司、9cm細菌培養皿（biosharp BS-90D，批號：200518）

1.3實驗動物

實驗動物SPF級SD大鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物使用許可證號：SYXK（桂）2019-0001。實驗大鼠于SPF級動物實驗房飼養，飼養環境12 h明暗交替，溫度（22 ± 2）℃，相對濕度（50 ± 10）%

2、方法

2.1氧化石墨烯（GO）液體創可貼制備工藝

按處方量用分析天平稱取PVA124并用10倍量的水溶脹2 h后，90℃水浴邊攪拌邊加熱使其完全溶解后靜止放冷后，按處方量加入甘油、苯扎氯銨（含量為0.017%）、和無水乙醇攪拌均勻后再加入一定量氧化石墨烯（GO）水溶液（2 mg/mL），之后用純水定容至100 ml。

2.2 不同濃度氧化石墨烯（GO）液體創可貼制備

按2.1制法制備出氧化石墨烯（GO）含量分別為50、85、120、155、190微克每毫升的液體創可貼。

2.3不同濃度氧化石墨烯液體創可貼抑菌

用接種環分別挑取金黃色葡萄球、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌菌落置于裝有生理鹽水的滅菌是試管中作為菌原液，按麥氏比濁法制備3×108 cfu/ml菌懸液。用移液槍吸取100微升菌懸液涂布于LB瓊脂培養基上后將分別浸泡在不同濃度液體創可貼10 min的7 mm藥敏試紙表面多余的液體除凈后將藥敏試紙輕輕放置于培養基表面后將培養皿置于37攝氏度培養箱中培養24小時后觀察抑菌圈大小。

2.4 氧化石墨烯（GO）液體創可貼對創面愈合的影響

2.4.1 SD大鼠全層皮膚缺損模型的造模：

隨機選15只體重在250 g[14] [15]左右的SD雄性大鼠適應性喂養1周后觀察健康狀況等良好后隨機分成5組，每組3只，一組為空白組（只除毛不涂藥），其余組按天數分組;大鼠在造模前禁食禁水8 h，稱重后，腹腔注射10 %水合氯醛按0.3 mg/100 g麻醉除去大鼠脊柱兩側的鼠毛（兩側除毛面積為0.6×0.6 cm），在除毛處使用酒精消毒后（使用眼科剪按標記剪出皮膚全層0.6×0.6 cm左右進行皮膚全切（真皮）給藥示意圖如圖1：

2.4.2 檢測指標取樣

大鼠造模后，分別于造模后第3、7、10、14天隨機挑選一組老鼠脫頸處死后用薄膜在傷口處描繪傷口面積后取傷口組織用4%多聚甲醛固定液固定。

2.4.3 創面愈合率計算

大鼠真皮皮膚全切后使用薄膜在傷口處描繪傷口面積后用質地均勻的紙板剪出相應的面積大小后用分析天平稱量后換算面積大小;愈合率 = （ 原創面面積 - 第n天創面面積） /原創面面積× 100% 。

2.4.4 VEGF（大鼠血管內表皮生長因子）陽性細胞數統計

固定后的組織經常規脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋、切片后采用免疫組化法染色后對每張切片進行 VEGF 檢測，本次免疫組化均由專業的病理醫師使用顯微攝像系統對切片進行圖像采集，每張切片先于100倍下觀察全部組織，再分別采集200倍顯微圖像，共采集3張，Halo數據分析系統計算每張圖像陽性面積占比（% DAB Positive Tissue）。

3、實驗結果與分析

統計分析采用SPSS23.0統計分析軟件。采用均數±標準差表示; 多組間計量資料比較符合正態分布采用單因素設計方差分析，多組間計量資料比較不符合正態分布采用非參數檢驗Kruskal-Wallis H法。P<0.05為差異有統計學意義。

3.1各不同濃度液體創可貼抑菌情況

表1：液體創可貼可知含有石墨烯（GO）的液體創可貼抑菌強度較沒有氧化石墨烯（GO）抑菌效果好，含氧化石墨烯（GO）120 ug/mL的液體創可貼抑大腸埃希氏菌菌和銅綠假單胞菌效果較其他濃度好，通過與基質組的對比發現氧化石墨烯對銅綠假單胞菌有一定的抑菌作用。含氧化石墨烯（GO）120 ug/mL的液體創可貼綜合評分較高，后以含氧化石墨烯（GO）120 ug/mL的液體創可貼做創面愈合實驗。

3.2創面面積及愈合率

第10天和第14天愈合率為嚴重偏態分布因此采用非參數檢驗。結果表示不同時間各組之間愈合率比較無顯著差異P>0.05。

3.3創面組織VEGF陽性占比

由表3分析知GO組和曼敦組在第三天時VEGF的表達較基質組和生理鹽水組強，通過GO組與基質組的比較，GO組早期對于創面VEGF的表達有一定的影響，可能在早期促進VEGF的表達，在第三天時各組VEGF表達強度較強，在第三天之后各組VEGF表達均呈減少趨勢。

討論

低濃度的氧化石墨烯（GO）有抑菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌）作用，抑金黃色葡萄球菌的作用較強，大腸埃希氏菌次之，對于銅綠假單胞菌的抑菌作用較弱，但較含0.017%苯扎氯銨佳。低濃度氧化石墨烯（GO）對于創面愈合的促進作用不大，但在創面愈合初期使用氧化石墨烯液體創可貼時其VEGF表達較生理鹽水處理的創面高的原因可能是其成膜后對創面起到保護作用并且其抑制細菌繁殖，預防創傷感染，因此在創傷初期對于VEGF的表達可能有促進作用。

GO 是一種優質的新型材料，在眾多領域中運用廣泛，隨著GO的廣泛應用，其表現出對生態環境、生物遺傳等方面存在一定風險。根據有關報道GO 具有生態毒性[16] [17]，通過機械損傷、氧化應激等影響動植物細胞調控，產生病理毒性和遺傳毒性，對小鼠肝臟、脾肺產生濃度依賴性的不同程度的毒性[18] [19]，對于GO在醫療領域的使用應確保其對人體無害，不產生遺傳毒性以及生殖毒性，規范GO的用量。本研究利用含氧化石墨烯190 μg/mL的液體創可貼進行抗菌測試，190 μg/mL的液體創可貼均有抑金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌作用，氧化石墨烯抑革蘭氏陽性菌強于革蘭氏陰性菌，其中120 μg/mL綜合抑菌作用較佳。對創面的愈合無促進作用。戴清儀公開發表的專利中提到含0.5 mg/mL以及2 mg/mL氧化石墨烯液體創可貼均能促進創面愈合，但2 mg/mL對細胞產生一定毒性，李龍劍公開發表的蘆薈苷氧化石墨烯凝肢的制備及其對創傷修復作用的研究提到其凝膠中含有0.125 μg/mL產生一定的抑菌效果，使蘆薈苷更能促進創面愈合。

[項目基金]：2020年大學生創業創新訓練項目，項目編號：202010600010

作者簡介：韋曉（2000年-），廣西中醫藥大學制藥工程專業，在讀本科。

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