血清毒蕈堿乙酰膽堿受體m3自身抗體水平對甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷價值

亞庫甫·托合提，張凱楠，趙輝，吾布里塔里甫·達吾提，張蕊，林仁勇，呂國棟，

本研究價值：

（1）甲胎蛋白（AFP）廣泛應用于肝細胞癌（HCC）的診斷，但約40%的肝癌患者AFP水平并不升高，針對這部分人群的癌癥篩查工作進行深入研究具有極重要的實際應用價值。（2）本研究發現血清毒蕈堿乙酰膽堿受體m3自身抗體（m3AchR-Ab）對 AFP陰性HCC具有較高的診斷效能，m3AchR-Ab與AFP進行聯合診斷可以提高HCC診斷效能。（3）m3AchR-Ab與HCC嚴重程度相關，可能在HCC發生、發展過程中發揮著重要作用，但是其具體作用機制尚不清楚，值得進一步研究。

本研究局限性：

本研究的樣本量較小，代表性稍差；本研究只探究了m3AchR-Ab在HCC中的表達水平，暫未評估其在其他腫瘤疾病中的表達情況。

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤之一［1］，死亡率居所有癌癥第三位。在中國因HCC死亡的癌癥患者僅次于肺癌［2］。HCC病因復雜，早期診斷難度大［3］。目前，甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）已廣泛應用于HCC的診斷［4-5］，但其靈敏度僅為41%～65%［6］。在臨床上AFP診斷HCC的截斷值為20 ng/mL，血清AFP水平＜ 20 ng/ml的HCC被稱為AFP陰性HCC［7-8］。AFP陰性HCC患者在早期篩查中容易被漏診，因此亟須尋找新型生物標志物用于診斷AFP陰性的疑似HCC患者。毒蕈堿乙酰膽堿受體m3自身抗體（muscarinic acetylcholine receptor m3 autoantibody，m3AchR-Ab）是原發性干燥綜合征［9］、原發性膽汁性肝硬化［10］等疾病的候選生物標志物。然而，有關其對AFP陰性HCC診斷價值的研究報道較少。本研究通過測量血清m3AchR-Ab水平，探討其對AFP陰性HCC患者的診斷價值，旨在為AFP陰性HCC患者的臨床診斷提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集新疆醫科大學第一附屬醫院標本庫于2011年11月至2015年9月入庫的257例患者血清樣本，其中90例為HCC患者（HCC組），89例為良性肝病（如肝硬化及肝血管瘤）患者（良性肝病組），78例為健康受試者（對照組）。納入標準：（1）HCC組患者均經病理組織學檢查確診，且符合《原發性肝癌病理診斷實踐指南（2015年版）》［11］；（2）良性肝病組患者均經臨床、免疫學、影像學及血清學檢查確診；（3）病歷資料完整；（4）參與本研究前未行手術、放化療等治療。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）合并免疫性疾病、血液系統疾病。受試者均簽署知情同意書，本研究通過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準（倫理審批號：k201906-06）。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 收集HCC患者一般資料，包括性別、年齡、腫瘤大小（最大直徑）和數量、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移、乙肝表面抗原（HBsAg）等；收集良性肝病患者和健康受試者的性別、年齡等資料。

1.2.2 血清AFP及m3AchR-Ab水平檢測 血清AFP水平的檢測采用雅培自動化學發光免疫分析儀（Abbott公司生產，型號：Abbott i2000SR）及配套試劑盒（Abbott公司生產，批號：Abbott 3P36/07P90），檢測步驟嚴格按照配套試劑盒說明書進行；血清m3AchRAb水平的檢測采用酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linkedimmunosorbent serologic assay，ELISA），檢測步驟嚴格按照m3AchR-Ab試劑盒（上海江萊生物科技有限公司生產，貨號：JL12216，生產批號：Mar 2021）說明書進行。

1.3 統計學方法 采用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析。不符合正態分布的計量資料以 M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清m3AchR-Ab水平對AFP陰性HCC患者的診斷價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組、良性肝病組、HCC組和對照組血清m3AchR-Ab水平比較 三組血清m3AchR-Ab水平比較，差異有統計學意義（H=126.30，P＜0.01）。HCC組血清m3AchR-Ab水平高于良性肝病組和對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；良性肝病組血清m3AchRAb水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 對照組、HCC組、良性肝病組血清m3AchR-Ab水平〔M（P25，P75），ng/ml〕Table 1 Levels of serum m3AchR-Ab among hepatocellular carcinoma patients，benign liver disease patients and healthy controls

2.2 HCC患者臨床特征與血清m3AchR-Ab水平的關系血清m3AchR-Ab水平在不同腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移及HBsAg表達情況的HCC患者中比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；血清m3AchR-Ab水平在不同性別、年齡、腫瘤數量和遠處轉移的HCC患者中比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 HCC患者臨床特征與血清m3AchR-Ab水平的關系〔n=90，M（P25，P75），ng/ml〕Table 2 Correlations of serum m3AchR-Ab level with clinicopathological characteristics in hepatocellular carcinoma

2.3 血清m3AchR-Ab、AFP水平診斷HCC的ROC曲線 血清m3AchR-Ab水平診斷HCC的ROC曲線下面積（AUC）為0.89〔95% CI（0.84，0.95）〕，最佳截斷值為74.00 ng/ml，靈敏度為88.89%，特異度為91.02%。血清AFP水平診斷HCC的AUC為0.88〔95% CI（0.82，0.93）〕，最佳截斷值為27.42 ng/ml，靈敏度為71.11%，特異度為95.81%，見圖1、表3。

2.4 血清m3AchR-Ab水平聯合血清AFP水平診斷HCC的ROC曲線 運用二元Logistic回歸分析得到血清m3AchR-Ab水平與血清AFP水平的聯合變量并進行ROC曲線分析，結果顯示，血清m3AchR-Ab水平和血清AFP水平聯合診斷HCC的AUC為0.90〔95% CI（0.85，0.95）〕，靈敏度、特異度分別為90.00%、80.02%，見圖1、表3。

圖1 血清m3AchR-Ab、AFP水平和二者聯合對HCC診斷價值的ROC曲線Figure 1 ROC curves of serum m3AchR-Ab，AFP，and m3AchR-Ab plus AFP in diagnosing hepatocellular carcinoma

表3 血清m3AchR-Ab、AFP水平及二者聯合對HCC的診斷價值Table 3 Diagnostic value of serum m3AchR-Ab，AFP and the combination of them for hepatocellular carcinoma

2.5 血清m3AchR-Ab水平診斷AFP陰性HCC的ROC曲線 經血清AFP水平檢測，90例HCC患者中25例為AFP陰性HCC（AFP＜20 ng/ml）。ROC曲線結果顯示，血清m3AchR-Ab水平診斷AFP陰性HCC和的AUC為0.69 〔95% CI（0.54，0.83）〕，最佳截斷值為 74.00 ng/ml，靈敏度為64.00%，特異度為91.02%，見圖2。

圖2 血清m3AchR-Ab水平對AFP陰性HCC診斷價值的ROC曲線Figure 2 ROC curve of serum m3AchR-Ab in the diagnosis of AFP-negative hepatocellular carcinoma

3 討論

在針對疑似HCC患者的診療過程中，目前主要依賴血清AFP水平來進行診斷，但是LUO等［12］提出，約40%的HCC患者血清AFP水平并未升高，所以針對AFP陰性的疑似HCC患者的篩查工作進行深入研究具有極重要的實際應用價值。本研究發現血清m3AchRAb水平對診斷HCC具有較高的靈敏度和特異度。相關研究顯示，m3AchR-Ab診斷HCC的靈敏度和特異度與AFP、甲胎蛋白異質體（alpha fetoprotein-L3，AFP-L3）、異常凝血酶原（protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ）等相當［13］。本研究還發現，通過聯合m3AchR-Ab與AFP可以將HCC的診斷靈敏度提高至90.00%。但本研究目前只檢測了m3AchR-Ab在HCC的表達水平，其是否在其他腫瘤中持續高表達仍然未知，需進一步研究并評估其特異性。

吳孟超院士團隊提出磷脂酰肌醇蛋白多糖3（glypican-3，GPC3）可以作為AFP陰性的HCC患者的有效篩查指標，其靈敏度為76.70%［14-16］。本研究結果顯示，m3AchR-Ab用于診斷AFP陰性HCC的靈敏度與GPC3接近，提示本指標也具有較高的診斷效能，m3AchR-Ab不僅可應用于臨床HCC患者的篩查，還能應用于AFP陰性的疑似HCC患者的篩查。此外，m3AchR-Ab與近年來報道的新型生物標志物，如環化酶相關蛋白 2［17］、AFP-L3［18］和 PIVKA- Ⅱ［19］等在診斷AFP陰性HCC時的靈敏度和特異度相當或較優。因此推測m3AchR-Ab是一種AFP陰性HCC的候選生物標志物，具有一定的臨床轉化價值和應用潛力。

本研究發現m3AchR-Ab在HCC患者血清中高表達，其水平與HCC患者腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移和HBsAg表達等臨床特征相關。既往研究認為毒蕈堿乙酰膽堿受體m3（m3AchR）參與了結腸癌、胃癌、乳腺癌和肺癌等惡性腫瘤的發生、發展［20］，但是鮮有報道提出m3AchR與HCC的發生、發展相關。本課題組推測m3AchR-Ab可能在HCC發生、發展過程中發揮著重要作用。YU等［21］研究提出，在缺乏外源性m3AchR激動劑的情況下，m3AchR-Ab可能對m3AchR產生激動作用，進而通過下游通路發揮生物學作用，這可能是m3AchR-Ab參與HCC進展的重要機制，但仍需更直接的證據，本課題組也會對該科學假說進行持續研究。

綜上所述，m3AchR-Ab是潛在的AFP陰性HCC的篩查指標，同時也可與AFP聯用以大幅提高診斷HCC的靈敏度，這在HCC診斷中具有重要臨床意義。

作者貢獻：亞庫甫·托合提進行研究的實施與可行性分析；亞庫甫·托合提、張凱楠進行結果的分析與解釋，撰寫論文；張凱楠進行數據整理；亞庫甫·托合提、張凱楠、呂國棟進行論文的修訂；趙輝進行數據收集；吾布里塔里甫·達吾提、張蕊進行統計學處理；林仁勇負責文章的質量控制及審校；呂國棟進行文章的構思與設計，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。