1，6-二磷酸果糖口服液對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡、氧化應激和能量代謝的影響及可能機制研究

王青偉，李悅，劉強，3，劉業發，夏昆，4，丁榮晶

流行病學數據顯示，近年來我國急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患病率呈上升趨勢［1］，隨著急診再灌注治療技術的推廣，AMI急性期患者死亡率降低，但5年后心力衰竭發生風險仍高達15%～30%［2］。現代醫學研究表明，心肌梗死后心肌缺血缺氧導致心肌細胞代謝異常，發生細胞凋亡、氧化應激和炎癥，引起心肌細胞壞死和纖維化，進而導致左心室重構，而左心室重構是心肌梗死后心力衰竭的主要原因［3-4］。目前，控制左心室重構的藥物主要針對心肌纖維化，包括β-受體阻滯劑和腎素-血管緊張素-醛固酮系統抑制劑。但也有研究發現，調節心肌能量代謝類藥物可減輕心肌缺血缺氧［5-6］。1，6-二磷酸果糖（fructose-1，6-diphosphate，FDP）注射液在臨床應用多年，大量研究證實其可以減輕缺血缺氧導致的心肌損傷［7-8］，但FDP口服液是否具有上述作用尚未知。本研究旨在探究FDP口服液對AMI大鼠心肌細胞凋亡、氧化應激和能量代謝的影響及可能機制，以期為FDP口服液用于AMI后心肌保護提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗時間為2020年12月—2021年6月。選取SPF級雄性SD大鼠20只，體質量200～220 g，20日齡，購于北京維通利華公司實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010。

1.2 主要實驗儀器與試劑

1.2.1 主要實驗儀器 BL-420S型小動物生物功能實驗系統、HX-100E型小動物呼吸機購自成都泰盟科技有限公司，石蠟切片機購自德國Leica，鼓風干燥箱（DHG-9055A）、電熱恒溫水浴槽購自上海一恒科學儀器有限公司，光學顯微鏡（Olympus，BX53）購自北京普瑞賽司儀器有限公司，超凈工作臺購自北京昌平長城空氣凈化設備工程公司，熒光酶標儀購自美國Thermo Scientific，微量加樣器購自法國Gilson，脫色搖床購自海門市其林貝爾儀器制造公司，電泳儀購自北京百晶生物技術有限公司，低溫離心機購自德國Sigma，SDSPAGE電泳系統、ChemiDoc MP化學發光成像系統購自美國Bio-rad，凝膠成像系統購自美國UVP。

1.2.2 主要實驗試劑 FDP口服液購自北京華靳制藥有限公司，HE染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒、TUNEL凋亡檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，蛋白提取液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE預制膠套裝試劑盒及二抗購自北京MDL，中等蛋白分子量marker購自北京Thermo，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-AKT）、β-actin抗體購自北京Bioss，聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（0.22 μm）購自美國Millipore，3MM 濾紙購自美國Whatman，ATP、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 模型制備及分組 將大鼠適應性飼養1周后，根據CURAJ等［9］方法構建AMI模型：腹腔注射2%戊巴比妥鈉（3 ml/kg）麻醉大鼠，經口氣管插管并連接動物呼吸機輔助呼吸，在大鼠左側胸壁第3～4肋間處備皮、開胸，暴露心臟，于左心耳根部下方2～3 mm處用6-0縫合線結扎左前降支。結扎后左心室前壁及心尖部變白，心電圖提示ST段抬高，即AMI造模成功。術畢，形成胸腔負壓，逐層關閉胸腔后肌肉注射2.5×104U青霉素以預防感染。將建模成功后存活24 h的12只大鼠隨機分成模型組、FDP組，每組6只，術后第3天開始給藥，其中FDP組予以FDP口服液1 ml灌胃，模型組予以等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，連續給藥21 d。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 HE染色檢測心肌組織形態學特征 連續給藥21 d后處死大鼠，在心臟梗死區的相同截面處切取心肌組織，并置于4%多聚甲醛中固定，PBS沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5 μm大小的石蠟切片。烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，按常規方法進行HE染色，光鏡下觀察心肌組織形態學特征。

1.4.2 Masson染色檢測心肌組織纖維化程度及心肌膠原面積 取石蠟切片，烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，按照Masson染色試劑盒操作說明書進行處理，光鏡下心肌纖維呈紅色、膠原纖維呈藍色，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析。計算心肌膠原面積，心肌膠原面積（%）=膠原纖維面積/（膠原纖維面積+心肌纖維面積）×100%。

1.4.3 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡率 取石蠟切片，烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，按照TUNEL染色試劑盒操作說明書進行處理，其中綠色熒光細胞核為凋亡的心肌細胞，由4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染的藍色細胞核為總細胞，計算心肌細胞凋亡率，心肌細胞凋亡率=凋亡的心肌細胞數量/總心肌細胞數量×100%。

1.4.4 比色法檢測心肌組織中ATP、SOD、MDA含量取左心室心肌組織并稱重，按比例加入0.9%氯化鈉溶液制成10%勻漿液，3 000 r/min離心10 min（離心半徑16 cm），取上清液，按照試劑盒說明書，采用磷鉬酸比色法檢測ATP含量，采用黃嘌呤氧化酶比色法檢測SOD含量，采用硫代巴比妥酸比色法檢測MDA含量。

1.4.5 Western blotting法檢測心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平 提取心肌組織蛋白，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，蛋白定量為5 mg/ml，加蛋白上樣Buffer，進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉移電泳方式轉移至PVDF膜。隨后將轉移好的膜（參考目的條帶分子量大小）對照marker進行裁剪，封閉后在4 ℃環境下孵育相應的一抗（PI3K 1∶1 000；p-AKT 1∶2 000；β-actin 1∶1 000）過夜，隨后在室溫下孵育兔二抗2 h，最后進行顯色和成像。以β-actin作為內參，采用Image J軟件分析條帶灰度值，即目標蛋白表達水平。

1.5 統計學方法 應用SPSS 24.0統計學軟件進行數據處理。符合正態分布且方差齊的計量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態分布或方差不齊的計量資料以M（QR）表示，組間比較采用非參數檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌組織形態學特征 HE染色結果顯示，模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，體積增大，間隙變寬；FDP組大鼠大部分心肌纖維排列較為整齊，間隙較為清晰，保持了心肌組織相對正常的結構和形態，見圖1。

圖1 HE染色檢測模型組和FDP組心肌組織形態學特征（×100）Figure 1 Morphological characteristics of myocardium detected by HE staining in model group and FDP group

2.2 心肌組織纖維化程度、心肌膠原面積 光鏡下，模型組大鼠心肌組織纖維化明顯，可見島狀存活的心肌細胞；FDP組大鼠心肌梗死程度明顯減輕，存活的心肌細胞增多，且與模型組大鼠相比，其心肌組織纖維化面積明顯縮小，見圖2。FDP組大鼠心肌膠原面積為（8.35±3.11）%，低于模型組的（24.97±11.30）%，差異有統計學意義（t=3.473，P＜0.01）。

圖2 Masson染色檢測模型組和FDP組心肌組織纖維化程度（×100）Figure 2 Degree of myocardial fibrosis detected by Masson staining in model group and FDP group

2.3 心肌細胞凋亡率 FDP組心肌細胞凋亡率為（16.39±5.31）%，低于模型組的（35.68±8.34）%，差異有統計學意義（t=4.778，P＜0.01），見圖3。

圖3 TUNEL染色檢測模型組和FDP組心肌細胞凋亡率（×100）Figure 3 Apoptosis rate of cardiomyocyte detected by TUNEL staining in model group and FDP group

2.4 心肌組織中ATP、SOD、MDA含量 FDP組大鼠心肌組織中ATP、SOD含量高于模型組，心肌組織中MDA含量低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 模型組和FDP組心肌組織中ATP、SOD、MDA含量比較（n=6）Table 1 Comparison of ATP，SOD and MDA contents in myocardial tissue between model group and FDP group

2.5 心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平 FDP組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.001），見圖4、表2。

表2 模型組和FDP組心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of expression levels of PI3K and p-AKT protein in myocardial tissue between model group and FDP group

表2 模型組和FDP組心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of expression levels of PI3K and p-AKT protein in myocardial tissue between model group and FDP group

注：PI3K=磷脂酰肌醇-3-激酶，p-AKT=磷酸化蛋白激酶B

組別 PI3K p-AKT模型組 0.26±0.03 0.26±0.03 FDP組 0.51±0.03 0.45±0.02 t值 13.305 11.545 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖4 Western blotting法檢測模型組和FDP組心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平Figure 4 Expression levels of PI3K and p-AKT protein in myocardial tissue detected by Western blotting method in model group and FDP group

3 討論

AMI是急性心肌缺血缺氧導致的心肌壞死，具有高致死率、高致殘率和醫療花費昂貴的特點［10］。自1990年以來，我國居民心肌梗死發病率逐年上升，并呈現年輕化趨勢，已成為公共衛生問題和突出的社會問題［1］。雖然目前臨床上有規范的藥物治療、急診再灌注治療方法，但心肌梗死后心力衰竭仍較常見，且與急性心肌缺血壞死的范圍和缺血缺氧時間密切相關。因此，臨床上迫切需要尋找新的方法來改善急性心肌缺血缺氧導致的心肌損傷，從而預防AMI后心力衰竭的發生。

FDP是醣酵解的中間產物，缺氧情況下其可提供外源性醣酵解的反應底物，可在一定程度上增加ATP產量［11-12］。有動物實驗表明，心肌缺血時輸入外源性FDP可避開兩步耗能的磷酸化過程，即己糖激酶和磷酸果糖激酶催化反應直接刺激丙酮酸激酶，恢復被阻斷的旁路代謝，產生比葡萄糖酵解多一倍的ATP，進而改善心肌缺氧狀態下的能量代謝［13-14］。心肌組織中ATP含量的提高可以逆轉缺血心肌細胞的異常代謝，降低心肌氧耗［15］。采用FDP注射液治療缺血性心臟病已有20余年，研究表明，FDP注射液可防止AMI范圍擴大，減輕缺血性心肌損傷及缺血再灌注引起的心肌損傷［7］。

由于FDP注射液需要靜脈輸注，使用不方便，故FDP口服液應運而生。FDP注射液和FDP口服液雖然是同一種藥物，但受生物利用度影響，口服液的臨床效果是否和注射液相同有待進一步研究。本研究結果顯示，模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，體積增大，間隙變寬；FDP組大鼠大部分心肌纖維排列較為整齊，間隙較為清晰，保持了心肌組織相對正常的結構和形態。光鏡下，模型組大鼠心肌組織纖維化明顯，可見島狀存活的心肌細胞；FDP組大鼠心肌梗死程度明顯減輕，存活的心肌細胞增多，且與模型組大鼠相比，其心肌纖維化面積明顯縮小。FDP組大鼠心肌膠原面積、心肌細胞凋亡率低于模型組，心肌組織中ATP含量高于模型組，表明FDP口服液可抑制AMI大鼠心肌纖維化及心肌細胞凋亡，改善心肌細胞能量代謝。

研究表明，心肌梗死時心肌缺血缺氧可產生過量的ROS，并使機體抗氧化能力降低［16］。本研究結果顯示，FDP組大鼠心肌組織中SOD含量高于模型組，心肌組織中MDA含量低于模型組，表明服用FDP口服液后AMI大鼠抗氧化能力增強、心肌氧化損傷減輕。而降低AMI期間心肌組織氧化應激水平是延緩心肌細胞損傷、促進心肌細胞再生的關鍵。此外，ROS還可激活磷脂酶，降解膜磷脂，破壞線粒體結構，降低線粒體膜電位，導致線粒體腫脹和破裂，并將凋亡物質釋放到細胞質中［16］。

研究表明，PI3K/AKT信號通路能通過抑制心肌細胞凋亡、促進心肌細胞生長、抑制炎癥反應、促進血管新生、調節細胞內鈣離子濃度、改善細胞能量代謝等抵抗心肌損傷，同時減緩心室重構和心力衰竭的發生［17-21］；此外，PI3K/AKT/Nrf2信號通路的激活還可減輕腦缺血再灌注誘導的神經炎癥、凋亡和氧化應激，而抑制此通路明顯減弱了其抗氧化、抗炎和抗凋亡活性［22］。本研究結果顯示，FDP組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平高于模型組，提示FDP口服液對AMI大鼠心肌細胞的保護機制可能有PI3K/AKT信號通路的參與，但還有待進一步驗證。

綜上所述，FDP口服液可抑制AMI大鼠心肌纖維化、心肌細胞凋亡、氧化應激，改善能量代謝，其機制可能與PI3K/AKT信號通路激活相關，這為減輕急性心肌缺血缺氧損傷和心肌保護提供了新的思路，但具體通路仍需要進一步實驗證實。

作者貢獻：丁榮晶進行文章的構思與設計，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理；王青偉、夏昆進行研究的實施與可行性分析；王青偉、李悅、劉強、劉業發進行數據收集、整理、分析，結果分析與解釋；王青偉、李悅負責撰寫、修訂論文。

本文無利益沖突。