黃芪甲苷脂質聚合物納米粒對缺血再灌注損傷誘導大鼠模型的影響

賴志昆 馮其茂 王 骕 胡曉貞

上海市中醫(yī)醫(yī)院心內科，上海 200071

缺血所引起的組織損傷是致死性疾病的主要原因，如冠狀動脈硬化導致的心肌梗死、腦卒中等。有研究發(fā)現[1]，對組織造成損傷的主要因素并非缺血本身，而是恢復血液供應后，過量的自由基攻擊這部分重新獲得血液供應的組織內的細胞所造成的。黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AA）是傳統(tǒng)中藥黃芪的重要活性成分之一，具有多種藥理活性，如提高損傷心肌細胞的存活率[2]、抗病毒、心臟保護[3]、抗氧化、抗老化[4]等作用。AA 在多種溶劑中溶解度較差[5]，這限制了其臨床應用。脂質聚合物納米粒（lipid polymerhybrid nanoparticles，LPNs）作為一種新型給藥系統(tǒng)，可以提高難溶性藥物的溶解性及生物利用度[6]，近年來備受關注。本研究通過構建缺血再灌注損傷誘導的大鼠模型，評價AA-LPNs 對缺血再灌注損傷誘導大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

AA、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]（購自大連美侖生物科技有限公司，貨號：MB1955、MB5649）；肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（購自南京建成生物工程研究所，批號：20200103、20200407、20200206、20200216）；TUNEL 檢測試劑盒（購自美國羅氏公司，貨號：11684795910）。

1.2 主要儀器

低溫離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，H2050R）；旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，R206 型）；全自動血生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，BS-220）；透射電子顯微鏡（日本JEOL，JEM-2100）；高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，Agilent 1260）。

1.3 實驗動物

SD 大鼠，清潔級，體重（180±20）g，購于北京華阜康生物科技有限公司。動物許可證號：SCXK（京）2019-0008。合格證號：SYXK（京）2019-0024。大鼠在標準化條件下適應性飼養(yǎng)1 周，實驗前自由飲水和進食。本研究遵循了上海市中醫(yī)醫(yī)院（以下簡稱“我院”）實驗動物保護和使用指南，并經我院實驗動物倫理委員會批準。

1.4 實驗方法

1.4.1 制劑制備及表征 參考文獻[7]制備AA-LPNs。將20 mg AA 溶于20 ml 丙酮，加入100 mg PLGA 作為油相。將15 mg 合成磷脂和15 mg 大豆卵磷脂用無水乙醇溶解（100 mg/ml），加入到40 ml 超純水中，65℃加熱至脂質充分分散均勻，作為水相。將油相邊攪拌邊倒入水相中，渦旋3 min。磁力攪拌器（300 r/min）室溫下攪拌2 h，旋轉蒸發(fā)除去丙酮。經0.8 μm 濾膜濾過，得到AA-LPNs。用透射電子顯微鏡及粒徑儀對其形態(tài)和粒徑分布進行測定。

1.4.2 藥代動力學研究 選取16 只大鼠按隨機數字表法將其分為常規(guī)組（8 只）和研究組（8 只）。實驗前，大鼠禁食不禁水過夜。將AA 和AA-LPNs 以40 mg/kg的劑量灌胃給藥，給藥體積1.5 ml。于灌胃0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00、12.00、24.00、48.00 h后分別從眼球靜脈叢中取血0.3 ml，分離血漿，采用高效液相色譜法分析兩組藥代動力學參數[藥物半衰期（t1/2）、藥峰時間（Tmax）、藥峰濃度（Cmax）、濃度-時間曲線下面積（area under the curve，AUC）（AUClast、AUCall）、平均滯留時間（mean residence time，MRT）（MRTlast、MRTall）]，數據采用winNonlin（6.1）軟件進行處理，并繪制濃度-時間曲線。

1.4.3 模型構建及給藥 選取60 只大鼠，從中隨機選取15 只作為假手術組，其余構建缺血再灌注損傷大鼠模型，造模成功后按隨機數字表法將其分為模型組、AA 組、AA-LPNs 組，每組15 只。參考文獻[8]進行動物模型建立：實驗前進行大鼠麻醉，隨后以仰臥位進行固定，開胸暴露出心臟，用無創(chuàng)縫合絲線穿過左心耳廓下方2 mm 處進行縫合結扎，30 min 后結扎下方的心肌呈現灰白色，心電圖出現S-T 段抬高后釋放縫合絲線，心臟再灌注2 h，構建大鼠缺血再灌注損傷模型。造模成功標準為缺血再灌注后，心肌舒縮功能出現障礙，形態(tài)上出現心肌梗死。縫合消毒后放回籠中飼養(yǎng)。假手術組除不進行結扎外其余操作與模型組完全相同。造模24 h 后，AA 組和AA-LPNs 組以40 mg/kg 劑量灌胃給藥，假手術組和模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液，給藥1 次/d，連續(xù)給藥4 周。

1.4.4 觀察指標 實驗結束后，采集四組動脈血，分離上層血清，通過全自動血生化分析儀對血清中CK、LDH、SOD、MDA 進行檢測，然后每組選取5 只大鼠處死并快速剖取心臟組織，采用4%多聚甲醛溶液固定，用于TUNEL 檢測心肌細胞凋亡情況[9]。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0 對所得數據進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AA-LPNs 表征

制備的AA-LPNs 呈類球形，均一圓整，平均動態(tài)直徑為（180±23）nm。見圖1。

圖1 黃芪甲苷脂質聚合物納米粒表征

2.2 常規(guī)組和研究組藥代動力學參數比較

常規(guī)組和研究組濃度-時間曲線見圖2。研究組的t1/2、Tmax、AUClast、AUCall、MRTall均高于常規(guī)組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 常規(guī)組和研究組藥代動力學參數比較（）

表1 常規(guī)組和研究組藥代動力學參數比較（）

注 AUC：曲線下面積；MRT：平均滯留時間

圖2 常規(guī)組和研究組濃度-時間曲線（n=8）

2.3 假手術組、模型組、AA 組和AA-LPNs 組血生化指標比較

模型組血清CK、LDH、MDA 含量均高于假手術組，SOD 含量低于假手術組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。AA 組 和AA-LPNs 組血清CK、LDH、MDA 含量均低于模型組，SOD 含量高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。AA-LPNs 組血清CK、LDH、MDA 含量均低于AA 組，SOD 含量高于AA 組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表2。

表2 假手術組、模型組、AA 組和AA-LPNs 組血生化指標比較（）

表2 假手術組、模型組、AA 組和AA-LPNs 組血生化指標比較（）

注 與假手術組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01；與AA 組比較，cP ＜0.05，ccP ＜0.01。AA：黃芪甲苷；AA-LPNs：黃芪甲苷脂質聚合物納米粒；CK：肌酸激酶；LDH：乳酸脫氫酶；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

2.4 假手術組、模型組、AA 組和AA-LPNs 組心肌細胞凋亡比較

假手術組、模型組、AA 組和AA-LPNs 組中均可見凋亡細胞，見圖3。模型組的細胞凋亡率高于假手術組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。AA 組和AA-LPNs 組的細胞凋亡率均低于模型組，且AA-LPNs組低于AA 組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），見圖4。

圖3 四組心肌細胞凋亡（200×）

圖4 四組心肌細胞凋亡率比較（n=5）

3 討論

難溶性藥物的低生物利用度對藥物的臨床應用產生不利影響。近年來，AA 已應用于各種新型藥物遞送系統(tǒng)，例如納米乳[10]、納米結構脂質載體[11]和自微乳[12]。上述新型藥物載體可在一定程度上提高AA 的溶解度和生物利用度，但仍然存在一定問題，如藥物易泄露、體內循環(huán)時間短等。本研究構建的AA-LPNs作為新的藥物遞送系統(tǒng)，旨在提高AA 的生物利用度，增強其對于缺血再灌注損傷誘導的大鼠心肌細胞的保護作用。藥物被LPNs 包載后可提高小腸上皮細胞的攝取[13]，一方面是由于增大了AA 的溶解度，另一方面表面修飾增強了其在胃腸道的黏液層擴散，實現藥物的持續(xù)緩慢釋放[14]。

LPNs 具有核-殼結構，核通常由可生物降解的材料如PLGA[13]和聚乳酸[15]形成，而殼通常由脂質材料如磷脂酰膽堿和甲氧基（聚乙二醇）-二硬脂酰基磷酸乙醇胺[16]組成。PLGA 對疏水性藥物具有很高的包載能力，可以控制藥物的釋放速率[17]。磷脂層的殼在生理功能上類似于細胞膜的表面，其可以增加納米顆粒的生物相容性，同時減緩藥物的泄漏[18]。LPNs 的雙層結構不僅可以包載單一藥物，而且可以實現不同性質藥物的共遞送[19]。此外，納米粒子的表面還可以被官能團修飾[20-21]，進一步促進細胞吸收并增強藥效。

基于上述理論，本研究制備的AA-LPNs 不僅可以提高AA 的溶解度，還可以提高其生物利用度，且對心肌細胞的保護作用。缺血再灌注損傷重要的病理機制之一是氧化應激[22-23]，血清中CK 和LDH 含量降低，會造成體內的氧化和抗氧化的平衡被打破，導致心肌功能損傷及細胞死亡。氧化應激過程中，有大量MDA 產生，抗氧化物酶SOD 被消耗[24]。因此，SOD 活性可間接反映心臟損傷程度[25-26]。綜上所述，AA-LPNs對缺血再灌注損傷誘導大鼠的心肌細胞具有保作用，其機制可能為AA-LPNs 提高大鼠SOD 含量，降低MDA含量，通過抑制氧化應激實現的。因此，AA-LPNs 作為抑制缺血再灌注損傷誘導的大鼠心肌細胞凋亡是一種很有前途的納米遞送系統(tǒng)。