漆酶固定化的工藝優化研究

◎ 楊靜思，劉玲怡，韓 琴，趙玉英，尹晟旭，劉太林

（天津天獅學院 食品工程學院，天津 301700）

漆酶是多酚氧化酶中一種含多個銅離子的糖蛋白氧化酶，其來源廣泛，在高等植物、真菌、細菌和動物等中都能發現[1]。漆酶是由日本學者研究發現，距今已有100多年，其中研究最廣泛的是真菌漆酶，不同來源的漆酶結構功能上都有一定的差異[2-3]。漆酶是一種綠色生物催化劑，反應產生水，能與抗壞血酸、胺、酚等物質反應，還能催化氧化多種難以降解的氯酚類污染物、染料、多環芳烴、生物色素、氯仿、苯系物及其衍生物以及山硝基甲苯等。其主要應用于催化底物、食品加工、生物檢測、工業廢水和造紙廢水處理等方面；但是游離的漆酶對外界敏感、穩定性差、易失活，不利于回收重復利用。對漆酶進行固定化研究不僅能解決這些問題，還能節約成本提高漆酶利用效率[4]。

固定化酶是指用某些載體和某些方法將游離的酶限制在一定的空間或吸附在某些載體上，使之不能隨意移動，但仍具有活性結構和功能[5]。酶的固定化顯著提高了酶的穩定性、重復利用率、抗逆性，受外界影響較小，使得酶可以在反應中重復利用。目前酶的固定化載體非常多，常用的有殼聚糖、尼龍網、二氧化硅、復合材料和活性炭等。固定化的方法有交聯法、吸附法、共價結合法、熱處理法和包埋法等[6]。酶固定化的核心要點是酶活性基本不降低，不影響酶的活性中心和結合位點，且其與載體結合牢固，不易脫落[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漆酶（上海寶曼生物科技有限公司）；尼龍網、2,2’-聯氮雙（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）、二銨鹽（ABTS，酷爾化學科技有限公司）；一次性注射器、海藻酸鈉（天津市光復精細化工研究所）；檸檬酸（天津市大茂化學試劑廠）；戊二醛、Na2HPO4、NaH2P04、HCL、CaCl2及甲醇溶液，均為分析純。

1.2 儀器與設備

AR124CN電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；UV-1000紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；SHB-III循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；XMTD-204數顯式電熱恒溫水浴鍋（天津市歐諾儀器有限公司）；WE-1水浴恒溫振蕩器（天津市歐諾儀器有限公司）；DT5-6B低速自動平衡離心機（北京時代北利離心機有限公司）；SB-3200DTDN超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；pH計（上海般特儀器制造有限公司）；BCD-254冰箱（博西華家用電器有限公司）；G90F23CN3LV-C2（S5）微波爐（廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 游離酶活力的測定

稱取1 g漆酶溶于40 mL蒸餾水中，攪拌均勻后2 000 r·min-1離心10 min，分離出上清液即為游離酶溶液，用于測定初始的酶活力；再取1 mL酶液，加入4.6 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，0.4 mL ABTS，利用分光光度計在420 nm處測定從起始到結束的吸光度值，然后根據公式（1）計算酶活力[8]。

1.3.2 固定化漆酶的制備

（1）包埋法固定漆酶。稱取一定量的海藻酸鈉，加入蒸餾水，置于微波爐中加熱使之溶解成均勻的海藻酸鈉膠體；取1 mL酶液加入到4 mL海藻酸鈉膠體中并攪拌均勻使其充分混合，然后用帶針頭的注射器將混合好的海藻酸鈉酶液逐滴滴入CaCl2溶液中，盡可能形成形狀大小相似的均勻球狀凝膠顆粒（2～3 mm），靜置20 min后，放于水浴搖床上振蕩固定。將振蕩完畢的固定化漆酶取出，用布氏漏斗濾去氯化鈣溶液，再用蒸餾水洗滌固定化漆酶凝膠顆粒，重復操作3次，以除去未固定化的氯化鈣，放于室溫下干燥，得到干燥固定化漆酶[9]。

（2）交聯法固定漆酶。對張書祥等[10]的試驗方法加以改進。取1 g尼龍網（1 cm×1 cm）洗凈、晾干，用18.6%CaCl2、18.6%水的甲醇溶液在室溫下保溫10 min，洗凈后吸干；于3.65 mol·L-1HCl中水解45 min，洗至pH中性，吸干；用不同濃度戊二醛進行交聯后取出并洗去多余戊二醛，立即加入適量酶液并在4 ℃下固定，用緩沖液清洗后得到固定化漆酶。

1.3.3 固定化漆酶活力測定

取1.3.2制備的固定化漆酶，加入4.6 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，0.4 mL ABTS在420 nm處測定從起始到結束的吸光度值，根據公式（1）計算酶活力。

1.3.4 結果計算

利用試驗中測定的吸光度值，計算固定化漆酶活力，計算公式如下[11]。

式中：A1為起始時的吸光度值；A2為結束時的吸光度值；t為吸光度值從A1增加到A2所經歷的時間，s；ε為消光系數 3.6×104［(mol·L-1)·cm］-1。

1.3.5 單因素試驗設計

以漆酶活力回收率作為指標，分別對以下因素水平進行單因素試驗設計。

（1）包埋法固定漆酶。海藻酸鈉質量分數分別取2%、3%、4%、5%和6% 5個不同質量分數。固定化溫度分別設置45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃ 5個不同溫度水平。CaCl2溶液濃度分別取 0.2 mol·L-1、0.3 mol·L-1、0.4 mol·L-1、0.5 mol·L-1和 0.6 mol·L-15 個不同濃度。

（2）交聯法固定漆酶。戊二醛質量分數分別取3%、4%、5%、6%、7%和8%。交聯時間分別設置為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h。固定時間分別設置為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 和 6 h。

1.3.6 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，分別對不同因素選取3個酶活力回收率最高的因素水平進行L9(34)正交試驗，以獲得最佳固定條件，見表1、表2。

表1 包埋法固定漆酶正交試驗設計表

表2 交聯法固定漆酶正交試驗設計表

2 結果與分析

2.1 包埋法固定漆酶單因素試驗結果分析

2.1.1 溫度對固定化漆酶的影響

不同溫度對固定化漆酶的影響見圖1。隨著溫度的增加，固定化漆酶的活力回收率也在增加，當溫度達到55 ℃時，固定化酶活力回收率達到了最大，當溫度繼續升高時，固定化酶活力回收率開始下降。溫度過高反而會降低漆酶的活性，因此選擇55 ℃為最佳固定溫度。

圖1 溫度對固定化酶活力回收率的影響圖

2.1.2 海藻酸鈉質量分數對固定化漆酶的影響

不同海藻酸鈉質量分數對固定化漆酶的影響見圖2。固定化漆酶的活力回收率隨海藻酸鈉質量分數的增長而增長，當海藻酸鈉質量分數到達3%時，酶活力回收率最高，隨后大幅度降低。這是因為海藻酸鈉的濃度在適當范圍內有利于微球成形，當海藻酸鈉濃度較大時，成球不規則，載體通透性會降低，導致酶活力回收率降低[12]。

圖2 海藻酸鈉質量分數對固定化酶活力回收率的影響圖

2.1.3 氯化鈣濃度對固定化漆酶的影響

氯化鈣濃度對固定化漆酶的影響見圖3。當氯化鈣濃度為0.2～0.4 mol·L-1時，隨著濃度的增大，固定化漆酶的活力回收率也逐漸升高，當濃度達到0.4 mol·L-1時，酶活力回收率達到了最大，當濃度逐漸上升時，酶活力回收率出現下降趨勢。這是由于CaCl2濃度過低時固定化凝膠比較松散，凝膠孔徑比較大，酶容易流失。而CaCl2濃度過高時，分布在凝膠表面的Ca2+會增多，并與酶發生反應導致固定化酶活力降低[13]。

圖3 氯化鈣濃度對固定化酶活力回收率的影響圖

2.2 交聯法固定漆酶單因素試驗的結果分析

2.2.1 戊二醛濃度對固定化漆酶的影響

不同戊二醛質量分數對固定化漆酶的影響見圖4。隨著戊二醛質量分數的增加，漆酶的活力回收率也隨之增加，在戊二醛質量分數為5%時，酶活力回收率達到最高，而后下降。這主要是因為過量的戊二醛可能會導致蛋白質變性，降低酶活性，從而影響酶活力回收率；此外，當戊二醛質量分數過大時，戊二醛易發生自聯反應，且聚集體過密阻礙了酶與底物的接觸[14]。

圖4 戊二醛質量分數對固定化酶活力回收率的影響圖

2.2.2 交聯時間對固定化漆酶的影響

交聯時間對固定化漆酶的影響見圖5。固定化漆酶活力回收率隨著交聯時間的增加而增加，并在交聯時間為4 h時，酶活力回收率達到最大，而后大幅度下降。這可能是由于隨著交聯時間的延長，結構越來越緊密，使得固定化酶的傳質阻力加大，造成酶活力降低，且長時間低溫下的交聯反應也會影響酶的活性[15]。

圖5 交聯時間對固定化酶活力回收率的影響圖

2.2.3 固定時間對固定化漆酶的影響

固定時間對固定化漆酶的影響見圖6。隨著固定時間的增加，酶活力回收率增加，在4 h時酶活力回收率最大，固定效果最好。之后再延長固定時間，酶活力回收率不僅無明顯提高，反而下降。這是因為固定時間過長可能會導致結構過于緊密，底物不易擴散，從而影響酶促反應速率，因此選擇固定時間為4 h。

圖6 固定時間對固定化酶活力回收率的影響圖

2.3 正交試驗結果

2.3.1 包埋法固定漆酶正交試驗結果

以固定化漆酶活力回收率為參考指標，由表3可知，各因素對酶活力回收率的影響大小依次為溫度＞海藻酸鈉質量分數＞氯化鈣濃度。從k值分析來看，在溫度55 ℃、海藻酸鈉質量分數3%、氯化鈣濃度為0.4 mol·L-1為固定漆酶的最佳工藝條件。由表4方差分析來看，溫度對酶的活力回收率影響顯著，海藻酸鈉質量分數和氯化鈣濃度影響不顯著。將正交試驗得到的最佳組合條件：溫度55 ℃、海藻酸鈉質量分數3%、氯化鈣濃度0.4 mol·L-1進行3次平行試驗，通過驗證試驗發現，在該條件下固定化漆酶的活力回收率分別為88%、89%、88%，均優于其他方案結果，且RSD值為0.80%＜5.00%，因此此最佳試驗條件得到驗證。

表3 包埋法固定漆酶正交試驗方案和結果表

表4 包埋法方差分析表

2.3.2 交聯法固定漆酶正交試驗

以固定化漆酶活力回收率為參考指標，由表5正交試驗R值分析可知，3個因素對固定化漆酶的影響顯著性依次為固定時間＞交聯時間＞戊二醛質量分數，說明固定時間對固定化漆酶的活力回收率的影響最為顯著。綜合考慮各因素，確定固定化漆酶的最佳交聯條件為5%戊二醛質量分數、4 h交聯時間、4.5 h固定時間。由于得到的最佳固定化條件沒有在正交試驗設計的9組試驗方案中，因此需要對該理論最佳條件做驗證試驗來驗證該方案的可靠性。通過驗證試驗發現，在該條件下固定化漆酶的活力回收率分別為82.2%、82.5%、81.8%，高于正交試驗中最高酶活力回收率，且RSD值為0.43%＜5.00%，由此可知，該方案具有一定的可靠性。

表5 交聯法固定漆酶正交試驗方案和結果表

表6方差分析結果顯示，固定時間對酶活力回收率最為關鍵，其他因素在此試驗范圍內沒有顯著差異，對測定結果的影響較小，與直觀分析結果一致。

表6 交聯法方差分析表

3 結論

（1）通過試驗結果可以確定溫度、包埋劑濃度（本試驗為海藻酸鈉）、氯化鈣溶液濃度、戊二醛質量分數、交聯時間和固定時間均對固定化漆酶的活力有不同的影響。

（2）正交試驗優化海藻酸鈉包埋漆酶的最佳工藝條件為溫度55 ℃、海藻酸鈉質量分數3%、氯化鈣濃度為0.4 mol·L-1，最優條件下的漆酶活力回收率的平均值為88.3%。

（3）正交試驗優化戊二醛交聯漆酶的最佳工藝條件為戊二醛質量分數5%、交聯時間4 h、固定時間4.5 h，且最優條件下的漆酶活力回收率的平均值為82.2%。

（4）本研究采用兩種方法對漆酶固定化工藝進行優化，所采用儀器簡單、操作方便，可以為漆酶的固定化工藝研究提供一定的參考依據。