胚胎滯留-立即二次移植臨床妊娠結局的回顧性病例匹配研究

李曉芳，師娟子，施文浩，柏海燕

(西北婦女兒童醫院生殖中心，西安 710003)

胚胎移植(ET)是輔助生殖技術體外受精(IVF)后最關鍵的步驟。當ET結束時，若發現胚胎滯留則需再次移植。胚胎滯留會令患者沮喪及焦慮，也會影響移植醫生的情緒，但胚胎滯留又無法完全避免。腹部B超引導可以改善IVF-ET助孕的臨床妊娠結局，困難移植發生率和胚胎滯留率均顯著降低，然而胚胎滯留率仍然可達0.3%～7.5%[1-3]。目前，導致胚胎滯留的原因尚不明確，可能的影響因素包括移植醫生的經驗、移植過程宮腔壓力變化、移植導管被宮頸粘液阻擋或血液污染等[4-5]。由于胚胎滯留在輔助生殖助孕中的發生率較低，因此，胚胎滯留-立即二次移植臨床結局的相關研究較少，并且不同研究間妊娠結局異質性較強。Visser等[6]研究發現，胚胎滯留-立即二次移植的臨床妊娠率較低，建議胚胎滯留患者可推遲1 d后再行ET以提高臨床妊娠率。Xu等[7]和Alvero等[8]研究發現，胚胎滯留-立即二次移植的臨床妊娠率顯著低于無胚胎滯留組。然而，Lee等[9]和Oraif等[1]研究發現，胚胎滯留-立即二次移植對臨床結局并無顯著影響。由此可見，輔助生殖助孕中胚胎滯留-立即二次移植對臨床結局的影響仍有爭議。因此，本研究擬通過對胚胎滯留-立即二次移植和無胚胎滯留患者進行回顧性病例1∶1匹配對照研究，探討胚胎滯留的發生率以及胚胎滯留-立即二次移植對IVF-ET臨床結局的影響。

資料與方法

一、研究對象

收集2019年1月至2021年6月于我院生殖中心行IVF/ICSI助孕患者的臨床資料。

納入標準：(1)行IVF/ICSI助孕；(2)新鮮移植的周期和凍融胚胎移植(FET)周期；(3)臨床及隨訪資料完整的周期。排除標準：(1)有精神疾病、嚴重心腦血管疾病等；(2)數據缺失以及失訪周期。

共納入28 089個移植周期。根據患者是否發生胚胎滯留進行分組，即胚胎滯留組(n=59)及非胚胎滯留組(n=28 030)。兩組患者進一步進行1∶1病例匹配，匹配因素包括：(1)女性年齡(±1歲)；(2)移植胚胎數目、類型(囊胚或卵裂期胚胎)以及優胚數目；(3)促排卵方案或FET內膜準備方案；(4)授精方式；(5)不孕年限(±2年)；(6)移植醫生的經驗；(7)移植胚胎學家的經驗。以上除了“移植胚胎學家”因素有部分病例不能完全匹配，其余1～6項匹配因素均為完全匹配。1∶1病例匹配后，胚胎滯留組和非胚胎滯留組各納入59個周期。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COH)、穿刺取卵及授精：根據患者年齡、體質量指數(BMI)、基礎竇卵泡數(AFC)以及基礎性激素水平等選擇適合的COH方案。動態監測卵泡發育情況及血清激素水平，促排卵一般持續約10 d左右。當有兩個或兩個以上的優勢卵泡(直徑≥18 mm)時，給予HCG誘發排卵，36 h后行B超引導下穿刺取卵術。之后行常規IVF或ICSI授精。

2.胚胎培養、評級：于37℃恒溫、5%CO2、5%O2和90%N2條件下培養胚胎。受精后43～45 h觀察卵裂期胚胎發育情況，91～120 h觀察囊胚期胚胎并進行評級。卵裂期胚胎通過觀察卵裂球數量、形態以及胚胎碎片率等進行綜合評分。根據卵裂球數量分為4個等級：8～10細胞胚胎劃分為I級，6～7或>10細胞被劃分為Ⅱ級，5細胞被劃分為Ⅲ級，<4細胞則劃分為Ⅳ級；根據卵裂球細胞均勻性分為4個等級：卵裂球大小均勻且形態規則為I級，卵裂球大小略不均勻、形態略不規則為Ⅱ級，卵裂球大小不均勻、形態不規則為Ⅲ級；卵裂球大小極不均勻、形態極不規則為Ⅳ級；根據細胞碎片率分為4個等級：細胞碎片率<10%的為I級，細胞碎片率10%～20%的為Ⅱ級，細胞碎片率20%～30%的為Ⅲ級，細胞碎片率>30%為Ⅳ級。根據以上3個方面進行綜合評級，將卵裂期胚胎劃分為I～Ⅳ等級，Ⅳ級為廢棄胚胎，I和Ⅱ級為優質胚胎，Ⅲ級為非優質胚胎[10]。囊胚評級亦通過囊胚擴張程度、內細胞團質量以及滋養外胚層質量3個方面進行綜合評價，其中擴張程度3～5級≥BB的囊胚為優質囊胚，其余可用囊胚為非優質囊胚[11]。

3.胚胎移植術：移植前，患者需充盈膀胱，在腹部B超引導下進行。取膀胱截石位，充分暴露宮頸，用無菌棉簽沾胚胎培養液清洗宮頸，腹部B超引導下置入1根移植外管，將胚胎及20 μl培養基加載至移植內管，為了方便移植時B超可視化，留5 μl左右氣泡(B超下可看到亮點)，將內管通過外管置入，在子宮底約1 cm左右進行移植。移植后用培養基對移植管進行沖洗，并置于顯微鏡下觀察沖洗液，若發現胚胎滯留，則立即進行二次移植。二次移植位置同第1次移植，若為部分胚胎滯留，二次移植位置略低于第1次移植位置。

4.ET：若無特殊情況(子宮內膜異位癥、未處理的輸卵管積水、宮腔黏連、孕酮升高等)均進行新鮮卵裂期胚胎或囊胚移植；若新鮮周期移植未妊娠、全胚冷凍或有凍存胚胎擬生育二胎患者，則進行FET。

5.妊娠結局判斷：移植囊胚后12 d或移植卵裂期胚胎后14 d測血HCG，血HCG≥7 U/L為HCG陽性；孕6周B超下可見宮內孕囊為臨床妊娠；HCG陽性患者孕6周未見宮內孕囊或臨床妊娠患者孕12周前發生自然妊娠丟失的為早期流產。

6.觀察指標：比較兩組患者的一般資料及臨床資料。一般資料包括：年齡、BMI、不孕年限、基礎FSH(bFSH)、移植前子宮內膜厚度等；臨床資料包括：胚胎種植率、HCG陽性率、臨床妊娠率及早期流產率。胚胎種植率=孕囊數/移植胚胎數×100%，HCG陽性率=HCG陽性周期數/移植周期數×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%，早期流產率=早期流產周期數/HCG陽性周期數×100%。

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三、統計學分析

結 果

一、胚胎滯留發生基本情況

本研究納入28 089個移植周期，其中11 987個周期為新鮮胚胎移植周期，16 102個周期為FET周期，總胚胎滯留率為0.21%(59/28 089)。新鮮移植周期的胚胎滯留率0.18%(22/11 987)與FET周期的胚胎滯留率0.23%(37/16 102)比較無顯著性差異(P>0.05)；移植D3卵裂期胚胎的胚胎滯留率0.22%(19/8 463)與移植D5/D6囊胚的胚胎滯留率0.20%(40/19 626)比較無顯著性差異(P>0.05)；移植≥2枚胚胎的胚胎滯留率0.35%(27/7 651)顯著高于移植1枚胚胎的胚胎滯留率0.16%(32/20 438)(P<0.05)。本研究中發現胚胎滯留的患者均立即進行第2次移植，僅1例由于第2次移植后仍有胚胎滯留，進行了第3次移植。

二、病例1∶1匹配后兩組患者的一般資料比較

根據匹配因素以1∶1匹配病例后，非胚胎滯留組和胚胎滯留組各納入59個周期，各組中新鮮移植為22個周期，FET為37個周期。

兩組間平均年齡、BMI、bFSH、不孕年限、內膜厚度以及移植周期數比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般資料比較(-±s)

三、病例1∶1匹配后兩組患者的妊娠結局比較

兩組間胚胎種植率、HCG陽性率、臨床妊娠率以及早期流產率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者的妊娠結局比較(%)

討 論

在過去的幾十年間，關于胚胎滯留-立即二次移植是否對IVF助孕結局有不良影響一直存在爭議。因此，本研究嚴格按照病例1∶1匹配研究，對本中心胚胎滯留-立即二次移植的IVF/ICIS-ET助孕結局進行分析。

本研究共納入28 089個胚胎移植周期，總胚胎滯留率為0.21%(59/28 089)，胚胎滯留率低于既往報道[1-2]。目前，胚胎滯留發生的原因尚不明確，可能的因素包括移植醫生的經驗、移植導管被宮頸粘液阻擋或血液污染等原因。既往文獻提示，胚胎移植前去除宮頸管粘液會縮短插管時間并可顯著提高臨床妊娠率[12-13]。ET是輔助生殖助孕最后且關鍵的一步，本中心ET操作一般由3位有豐富臨床經驗的副主任醫師以上級別醫生進行，且移植前會對宮頸粘液進行充分清洗，放置胚胎位置在距離宮底1～1.5 cm處，為了避免刺激子宮收縮，盡量輕柔操作。本中心參與ET操作的臨床醫生以及胚胎學家評估的胚胎滯留情況基本一致，提示移植醫生以及胚胎學家之間的質控基本沒有差異。

既往文獻多集中于分析卵裂期胚胎滯留-二次移植對臨床結局的影響，而對移植囊胚-二次移植的胚胎滯留率及妊娠結局的研究相對較少。有研究發現，囊胚透明帶在孵化時更加脆弱，ET操作可能會對囊胚造成一定程度的損傷，且D5/D6囊胚相較D3卵裂期胚胎體積更大，擴張后密度更低，移植D5/D6囊胚更容易發生胚胎滯留[9，14]。但本研究結果顯示，移植D3卵裂期胚胎的胚胎滯留率與移植D5/D6囊胚比較無顯著性差異(0.22% vs. 0.20%，P>0.05)，這與既往幾篇文獻[7，15-16]結果相符。Yi等[15]研究發現，單囊胚移植后無胚胎滯留發生，而移植2枚囊胚的胚胎滯留率為3.5%，提示移植胚胎數目越多發生胚胎滯留的風險越高；我們的研究結果與之一致，移植≥2枚胚胎的胚胎滯留率顯著高于移植1枚胚胎(0.35% vs. 0.16%，P<0.05)。本研究結果還發現，FET周期的胚胎滯留率略高于新鮮移植周期，但尚無顯著性差異(0.23% vs. 0.18%，P>0.05)，這與Lee等[9]的研究結果相符。

影響IVF助孕妊娠率的因素，包括女性年齡，移植胚胎數目、類型以及優胚數目、促排卵方案或FET內膜準備方案、授精方式、不孕年限及人為因素(移植醫生及胚胎專家的經驗)等，本研究為了減少這些可能因素的影響，進行了嚴格的病例1∶1匹配研究。通過嚴格的病例1∶1匹配后研究發現，胚胎滯留組的胚胎種植率、HCG陽性率、臨床妊娠率及早期流產率與非胚胎滯留組比較均無顯著性差異(P>0.05)，這與既往多篇研究[1，9]結果相符。

由于胚胎滯留事件的特殊性，僅能進行回顧性研究分析，本研究是單中心的回顧性研究，存在回顧性研究固有的缺陷和選擇偏倚等問題；此外，本研究未對移植管粘液或血液污染進行分析，存在一定局限性。移植導管被粘液/血液污染與否對胚胎滯留發生的影響目前尚無明確結論，較早文獻發現，移植導管無粘液/血液污染組的胚胎滯留率與有粘液/血液污染組比較無顯著性差異，且當導管無粘液或血液污染時，胚胎滯留組的臨床結局與非胚胎滯留組比較無顯著性差異(P>0.05)[17]；但最近有文獻提出，粘液/血液污染可能增加胚胎滯留的發生，且血液污染可能對妊娠結局帶來一定負面影響[18]。移植導管被血液或粘液污染是否導致胚胎滯留并影響妊娠結局尚需要后續進一步深入探討。

綜上，本研究是目前胚胎滯留相關研究中納入移植周期數較多的一項研究，且通過嚴格的病例1∶1匹配對照研究，結果顯示胚胎滯留-二次移植對IVF/ICSI-ET的臨床結局無明顯影響；但胚胎滯留事件可能導致患者產生不良情緒，應盡量避免。另外，移植胚胎數目增多會增加胚胎滯留的風險，因此臨床工作中仍推薦單胚胎移植，可以同時降低胚胎滯留和多胎妊娠的發生風險。