低氧對體外人子宮內膜蛻膜化基質細胞內膜崩解相關因子mRNA表達水平的影響

張欣，武斌，陳西華，王樹芳，魯聰，劉婷婷，楊旭清，賀斌，徐祥波*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；3. 山東大學附屬濟南市中心醫院，濟南 250013；4.新鄉醫學院，新鄉 453003；5. 遵義醫科大學，遵義 563006)

月經是女性體內重要的生理現象，自青春期開始至絕經結束，在雌激素和孕激素的嚴密調控下，子宮內膜可發生周期性變化即月經周期，月經周期通常分為增生期、分泌期、月經期。月經周期過程中子宮內膜、血管腺體發生動態變化，子宮內膜經歷大規模崩解出血和重塑，但對于月經發生機制的研究目前仍不明確。經典的月經發生假說為Markee[1]利用恒河猴對月經發生開展的研究。在恒河猴的眼前房中植入人子宮內膜外植體，研究發現在月經產生前，螺旋動脈血管節律性舒張和收縮，螺旋動脈持續收縮約24 h后，子宮內膜組織發生崩解并出血。因此推測，月經可能是由于子宮內膜螺旋動脈持續收縮導致低氧，組織血供減少，缺血壞死從而崩解出血。

不同研究組關于低氧是否直接導致子宮內膜崩解等關鍵問題眾說紛紜。子宮內膜的低氧狀態可以通過子宮內膜血流減少、血氧分壓降低和檢測低氧標志物(派諾硝唑)判定。根據一項利用核素133氙(133Xe)清除技術的研究發現，子宮內膜血流在臨月經期前或月經期間并未減少[2]。Gannon等[3]使用激光多普勒技術也未在人類月經周期各個時間發現子宮內膜組織低氧缺血或月經期出血的證據。Zhang等[4]研究發現，低氧條件下，與子宮內膜崩解密切相關的基質金屬蛋白酶proMMP-1、proMMP-3和MT1-MMP的生成以及MMP-2的活化受抑制，低氧誘導因子(HIF)1A僅在少數人子宮內膜圍月經期標本的基質細胞中存在。Coudyzer等[5]研究發現人子宮內膜異體移植物在激素撤退處理時會發生蛻膜化并崩解，但并未發現氧分壓顯著變化，只在部分移植物中發現低氧標志物派諾硝唑的表達。以上研究顯示低氧狀態并未在子宮內膜組織大范圍存在，在子宮內膜崩解前并未出現低氧。然而，也有多項研究支持月經期間存在低氧現象。Fan等[6]發現在小鼠月經模型中，孕酮撤退后2 d，在組織邊緣發現低氧標志物陽性顯色。有研究發現孕酮撤退后8 h和24 h在子宮內膜的分離區和蛻膜化細胞中發現低氧狀態存在[7-8]。本研究室前期研究利用小鼠月經模型發現在子宮內膜崩解期間HIF1A存在[9]且表達增加[10]。上述研究提示低氧與子宮內膜崩解相關，但是否存在始動關系并不明確。

本研究以體外人蛻膜基質細胞模型為基礎，分別進行孕酮撤退/維持與不同氧濃度培養聯合處理，探索HIF1A的表達與激活狀態，以及不同孕酮濃度與氧分壓條件下崩解相關基因MMPs的表達變化，以期探究低氧和HIF1A與子宮內膜崩解的始動關系。

材料與方法

一、研究對象

人子宮內膜組織樣本取自月經周期10～15 d、因醫學指征行子宮切除術的正常月經周期婦女(38～45歲，6例)，所有對象在過去3個月未接受任何激素治療。樣本在組織學上被指定為增生晚期或分泌早期。根據之前文獻方法[11-12]分離和培養人子宮內膜基質細胞(hESCs)。

二、主要試劑與儀器

孕酮(Sigma-Aldrich，美國)，密封細胞培養箱(Thermo Fisher Scientific，美國)，兔抗催乳素(PRL)多克隆抗體(1∶250，A0569，Dako，丹麥)，蘇木素伊紅染液(珠海貝索)、山羊抗兔增強二步法檢測試劑盒(PV-6001，北京中杉金橋)和DAB顯色試劑盒(ZLI-9018，北京中杉金橋)，核蛋白提取試劑盒(NE-PER，Thermo Fisher Scientific，美國)，兔抗HIF1A單克隆抗體(1∶500，NB100-134，Novus，美國)，兔抗β-Actin單克隆抗體(1∶2 000，北京科溫)，小鼠抗LAMIN-B1單克隆抗體(1∶200，SC-20682，Santa Cruz，美國)，兔抗PRL單克隆抗體(1∶200，MA1-610，Invitrogen，美國)，山羊抗兔二抗(proteintech，美國)，山羊抗小鼠二抗(proteintech，美國)，PRL檢測試劑盒(SCA846Hu，武漢克隆科技)，StepOneTM實時PCR系統(ABI，美國)，Trizol(Invitrogen，美國)，逆轉錄試劑盒(Takara，日本)，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Takara Bio，日本)，Bis-Tris凝膠(Nu-PAGE Novex，Invitrogen，美國)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF，Millipore，英國)，辣根過氧化物酶(HRP)標記小鼠抗兔IgG(1∶10 000，Sigma，英國)，增強型化學發光(ECL)系統(P2300，蘇州新賽美)，化學發光儀(K3Plus，上海寶予德)。

三、研究方法

1.實驗分組：將人子宮內膜蛻膜基質細胞按孕酮撤退(PW+)、孕酮維持(PW-)、正常氧培養(低氧-)、低氧培養(低氧+)聯合處理，共分為4個實驗組：PW-低氧-組，PW-低氧+組，PW+低氧-組，PW+低氧+組。孕酮撤退即使用無激素培養基替換原含激素的蛻膜化誘導培養基；孕酮維持即繼續使用含激素的蛻膜化誘導培養基培養細胞。正常氧培養為21%O2的常規體外細胞培養條件；低氧培養為2%O2的低氧培養條件。除此之外，其他均按常規的體外細胞培養條件，即37℃、5%CO2和93%N2。

2.hESCs分離：將術中取下的人子宮內膜組織，在無菌條件下使用Hank’s緩沖液沖洗子宮內膜，洗凈血凝塊。將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊，濾凈緩沖液，加入3～5倍體積的0.25%膠原酶Ⅳ(Sigma，美國)混勻，置于37℃培養箱中60 min，每隔15 min混勻，使細胞充分分離。加入DNA酶(Merkur，美國)，并用200目(孔徑68 μm)、400目(孔徑37 μm)和500目(孔徑30 μm)的無菌不銹鋼篩網依次過濾，收集過濾液，1 500 r/m離心5 min，棄去上清，沉淀主要為hESCs。

3.細胞培養與純化：往沉淀中加入含10%活性炭吸附胎牛血清(charcoal stripped FBS，Gibco，Thermo Scientific，美國)、100 U/ml青霉素(Merkur，美國)和100 mg/ml鏈霉素(Merkur，美國)的無酚紅DMEM/F12培養基(Gibco，Thermo Scientific，美國)重懸，臺盼藍染色計數，以5×106細胞量接種于25 cm2培養瓶(Corning，美國)，培養瓶置于37℃、5%CO2培養箱中培養。利用子宮內膜基質細胞與上皮細胞貼壁時間的差異進行基質細胞純化。細胞接種90～120 min后，更換新的培養基繼續培養。

4.hESCs體外誘導蛻膜化：蛻膜化組處理方式為用含2%活性炭吸附胎牛血清(Gibco，Thermo Scientific，美國)、100 nmol/L甲羥孕酮(MPA)(Merkur，美國)、10 nmol/L雌二醇(E2)(Sigma，美國)、加入抗生素的無酚紅DMEM/F12培養基(Gibco，Thermo Scientific，美國)聯合培養hESCs 11 d，每48 h更換1次培養基。使用無激素基礎培養基培養hESCs作為誘導對照組，培養11 d，每48 h更換1次培養基。

5.hESCs蛻膜化驗證：采用細胞免疫組織化學法。用無菌多聚賴氨酸預處理玻璃片5 min，風干后，放入24孔或6孔板中，鋪平。將細胞懸液滴入24孔板或6孔板中，待細胞長到一定時間，取出爬片。用PBS緩沖液清洗爬片10 s/次，使用4%甲醛固定15 min；PBS清洗5 min/次，洗2次，使用封閉液封閉10 min；加入兔抗PRL單克隆抗體4℃孵育過夜，PBS清洗5 min/次，洗2次；加入山羊抗兔增強二步法檢測試劑盒(PV-6001，北京中杉金橋)，37℃孵育1 h，PBS清洗5 min/次，洗2次；進行DAB顯色、復染、脫水、透明、封片，在顯微鏡下進行閱片。

6. 細胞培養上清液中PRL的檢測：使用化學發光免疫分析方法(CLIA)試劑盒(SCA846Hu，武漢克隆科技)。吸取蛻膜化組與誘導對照組的0、2、4、6、8和9 d細胞培養上清液，低溫離心機12 000 r/m 離心5 min，吸取上清待測。標準品與待測樣本在相同條件下，37℃孵育1 h；吸棄板中液體，加入檢測溶液A 100 μl，37℃孵育1 h；洗板3次；加檢測液B 100 μl，37℃孵育30 min；洗板5次；加底物100 μl，37℃孵育10 min；將測試板加入化學發光儀進行讀數。

7. 實時定量PCR檢測：利用Trizol從培養的hESCs中提取總RNA。用大約2 μg總RNA，通過逆轉錄酶合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑在StepOneTM實時定量PCR系統(Applied Biosystems，美國)上進行PCR檢測，各基因使用特定的引物(引物序列詳見表1)。使用β-Actin作為內部對照。熱循環條件如下：啟動激活周期95℃ 5 min，之后40個變性周期(95℃ 10 s)，退火，擴增(60℃ 34 s)。測定人MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9和MMP-13的相對mRNA表達水平。所有反應重復3遍。使用2-ΔΔCt法進行定量計算，其中ΔΔCt為校準Ct值。

表1 實時定量PCR分析的引物序列

8.免疫印跡分析(Western blot)：通過免疫印跡法分析檢測HIF1A蛋白。使用核質提取試劑盒(Thermo Scientific，美國)提取胞核和胞漿蛋白。之后，以2∶1的比例將15 μg胞漿或胞核蛋白懸于Laemmli緩沖液(125 mmol/L Tris-HCl，4%十二烷基硫酸鈉、5% 2-巰基乙醇、20%甘油和0.05%溴酚藍)(上海碧云天)，在95℃變性5 min。使用4%～12% Bis-Tris凝膠分離蛋白，轉移到PVDF膜上。用含有吐溫-20的5%脫脂奶粉Tris緩沖鹽水(北京索萊寶)在室溫下封閉膜1 h。將PVDF膜與抗HIF1A抗體4℃孵育過夜。對于胞漿蛋白，使用抗β-Actin抗體作為內參；對于胞核蛋白，使用抗-LAMIN-B1抗體作為內參。洗滌后，將膜與HRP標記的小鼠抗兔IgG室溫孵育2 h。之后在PVDF膜上滴加ECL，使用發光儀進行蛋白顯影。

四、統計學分析

結 果

一、hESCs體外誘導蛻膜化

1.形態學觀察：將純化的hESCs接種到6孔板后，待細胞長到70%～80%(約3 d)，然后進行誘導蛻膜化處理。誘導前，hESCs呈梭形，散落鋪在6孔板上(圖1A)。將hESCs誘導蛻膜化后，細胞形態開始變大變圓，細胞界限逐漸模糊(圖1B)，同時與誘導對照組的hESCs進行對比，誘導對照組細胞仍呈現梭形(圖1C)，細胞形態與誘導前細胞(圖1A)幾乎沒有發生變化。

2.免疫組化法檢測PRL蛋白的表達：結果顯示，蛻膜化誘導后在細胞的胞漿中檢測到PRL陽性信號(圖1D)。

3.蛻膜化細胞上清液中PRL的濃度：誘導對照組PRL表達量一直維持在極低水平。蛻膜化誘導后，細胞上清液中PRL濃度隨著時間延長逐漸增加，在蛻膜化誘導第8天達到峰值，第9天的表達量有所下降(圖1E)。

A：hESCs蛻膜化誘導前；B：hESCs蛻膜化誘導后；C：hESCs誘導對照組；D：hESCs蛻膜化誘導后PRL蛋白表達；E：hESCs上清中PRL含量檢測：與誘導對照組比較，**P<0.01。圖1 誘導hESCs蛻膜化

二、各組細胞質和細胞核中HIF1A蛋白表達水平比較

結果顯示，PW-低氧+組細胞質中HIF1A表達水平顯著低于PW-低氧-組(P<0.05)，而細胞核中的HIF1A表達水平顯著高于PW-低氧-組(P<0.05)；PW+低氧+組細胞質中HIF1A表達水平與PW+低氧-組無顯著性差異(P>0.05)；PW+低氧+組細胞核中HIF1A表達水平顯著高于其他3組(P<0.05)(圖2)。結果提示孕酮撤退與低氧能促進HIF1A激活。

三、各組細胞中MMPs mRNA表達水平比較

結果顯示，PW-低氧+組與PW-低氧-組MMPsmRNA表達水平無顯著性差異(P>0.05)；但與PW-低氧-組比較，PW+低氧-組MMP-1、MMP-3及MMP-7 mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)；與PW-低氧+組比較，PW+低氧+組MMP-1、MMP-3 mRNA表達水平顯著增高(P<0.01)(圖3)。

A：Western blot檢測細胞質中HIF1A表達；B：Western blot檢測細胞核中HIF1A表達；C：細胞質中HIF1A相對表達水平；D：細胞核中HIF1A相對表達水平。與PW-低氧-組比較，*P<0.05；與其他3組比較，#P<0.05。圖2 各組人蛻膜化基質細胞中HIF1A表達

注：與PW-低氧-組比較，*P<0.05，**P<0.01；與PW-低氧+組比較，#P<0.01。圖3 各組細胞中MMPs mRNA表達水平比較

討 論

女性月經是重要的生理現象，其在雌、孕激素的嚴密調控下經歷周期性變化。月經周期異常容易導致月經出血過多、月經不調、腹痛、閉經、絕經等，影響女性生殖健康和生活質量，甚至引發家庭經濟問題[13]。月經發生相關的研究及其對女性生殖健康的影響仍然值得關注。

月經的發生需要必要的激素、hESCs蛻膜化和孕酮撤退這3個條件[14-15]。hESCs蛻膜化時基質細胞生化和形態學發生變化，這是發生在月經周期中后期的重要生理事件。在這一過程中蛻膜基質細胞變圓變大，這種形態學的改變導致PRL等標記基因的表達增加[16]。本研究通過觀察hESCs的形態，檢測細胞中PRL含量變化，驗證hESCs體外誘導蛻膜化造模成功。

不同的研究組通過動物模型或人子宮內膜細胞對低氧與月經發生之間關系的研究結果各不相同。Reavey等[17]提出了一種非侵入性檢測子宮內膜低氧的技術，并發現人月經周期子宮內膜中低氧標志物表達顯著升高。同時本研究室前期研究中利用小鼠月經樣模型發現在子宮內膜崩解期間HIF的表達增加[10]。本研究結果顯示，PW-低氧+組與PW-低氧-組相比，細胞質的HIF1A表達明顯降低，但胞核中的表達顯著增高(P<0.05)。此外，PW+低氧+組和PW+低氧-組間，細胞質HIF1A表達水平無顯著變化，但PW+低氧+組細胞核的HIF1A表達顯著增高(P<0.05)，提示孕酮撤退與低氧有利于細胞核中HIF1A的激活。有研究稱，月經是孕酮撤退引發的生理事件[18]，這也提示子宮內膜細胞崩解后低氧狀態的存在。

hESCs發生蛻膜化時MMPs降解基質組織的行為增強[19]。MMPs是月經期間發揮重要作用的裂解酶，有文獻報道MMPs在恒河猴子宮崩解期間發揮重要作用[20]。孕酮撤退使得MMP-1，-2，-3在月經周期表達下降，并抑制月經[21]。在Zhang等[4]的研究中，人子宮內膜細胞在低氧條件下通過激素撤退培養，這些低氧培養細胞之后進行正常氧恢復培養，結果顯示低氧組MMP-2、pro MMP-1和pro MMP-3的產生被抑制。還有研究報道在低氧條件下培養24 h后，可以在整個子宮內膜外植體的培養物上清液中觀察到MMPs的表達減少[22]。本研究檢測崩解相關因子MMPs的表達，結果顯示PW-低氧+和PW-低氧-組的MMPsmRNA表達無顯著差異。但是，PW+低氧-組與PW-低氧-組相比，孕酮撤退使MMP-1、MMP-3及MMP-7 mRNA的表達顯著增高(P<0.05)；在PW+低氧+組，MMP-1表達水平比PW-低氧+組增高約5倍(P<0.01)，MMP-3表達增高約3倍(P<0.01)。提示孕酮撤退顯著提高了MMP-1、MMP-3和MMP-7的表達水平(P<0.01)，這與先前在獼猴[21]、小鼠[23]和人類[24]研究子宮內膜崩解過程中關于MMP-1、MMP-3和MMP-7的研究結果一致。提示低氧參與了在子宮內膜崩解激活后MMPs的調節。孕酮撤退后低氧條件下顯著增強了MMP-1和MMP-3的mRNA表達，表明MMP-1和MMP-3的表達是由孕酮撤退觸發的，并且因低氧狀態增強表達，低氧在子宮內膜崩解被激活后參與MMPs調節。這些體內和體外證據顯示，低氧參與了子宮內膜崩解，但尚未確定孕酮撤退對低氧的功能調節。