人工卵巢的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景

黃嫦嫦，殷偉蔚，金敏，封純*

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，杭州 310009；2.杭州市臨平區(qū)第一人民醫(yī)院婦科，杭州 311100)

隨著腫瘤診斷和治療技術(shù)的發(fā)展，腫瘤患者的生存率明顯提高，但腫瘤治療中的化療和放療可能會(huì)破壞女性卵巢儲(chǔ)備功能，導(dǎo)致不孕不育、更年期癥狀、骨質(zhì)疏松和內(nèi)分泌功能障礙等，從而降低女性的生育力和生活質(zhì)量。目前，胚胎冷凍、卵母細(xì)胞冷凍是可行的生育力保存方式，但有一些腫瘤患者因病情不允許或青春期前的女性不能進(jìn)行促排卵治療而不能使用該技術(shù)[1]。此外，胚胎冷凍、卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)局限于腫瘤治療后可恢復(fù)生育能力的患者，其并不能改善因卵巢功能減退導(dǎo)致其他副作用的患者的生育需求。為解決上述問題，有研究者采用放、化療前凍存卵巢組織，腫瘤治愈后再植入的方法保存生育力。有研究發(fā)現(xiàn)，凍融卵巢組織移植術(shù)后可獲得妊娠或者活產(chǎn)[2]。目前，凍融卵巢組織移植術(shù)的活產(chǎn)率可達(dá)到35%以上[3]。

盡管卵母細(xì)胞沒有引入腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，但周邊卵巢組織可能被侵犯，如血液淋巴系統(tǒng)及卵巢的惡性腫瘤可能將癌細(xì)胞重新引入體內(nèi)，所以，更安全的方法是構(gòu)建人工卵巢(artificial ovary)。Laronda等[4]通過3維(3D)打印技術(shù)將明膠制成生物支架，在支架中植入卵泡后分別移植到9只小鼠體內(nèi)，隨后在7個(gè)人工卵巢中發(fā)現(xiàn)了存活的卵泡，且卵泡分泌激素刺激乳汁生成，提示人工卵巢具有生育力保存和維持正常內(nèi)分泌的功能，也證明組織工程學(xué)與生殖醫(yī)學(xué)的結(jié)合是未來發(fā)展的可行方案。Pors等[5]通過去除人卵巢組織中易造成癌細(xì)胞生長的成分，制作出“脫細(xì)胞支架”，再將未成熟的人和小鼠卵泡與其整合后移植到雌性小鼠中，發(fā)現(xiàn)大約有25%的人類和小鼠卵泡可以恢復(fù)活性，這標(biāo)志著人類卵泡首次在“脫細(xì)胞支架”上存活下來。由此推斷，人工卵巢可能解決腫瘤患者的生育問題并提高生活質(zhì)量。

一、人工卵巢簡介

人工卵巢是指在生物材料構(gòu)成的半固體3D骨架結(jié)構(gòu)內(nèi)種植未成熟卵泡、卵巢基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞后形成的復(fù)合物[6-7]。其常用的生物材料包括藻酸鹽、殼聚糖、細(xì)胞外基質(zhì)、纖維蛋白、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、聚乙二醇(PEG)等[8]。人工卵巢移植入生物體內(nèi)后，未成熟卵泡可發(fā)育成熟并分泌性激素。患者可以選擇冷凍保存卵巢組織或整個(gè)卵巢，需要妊娠時(shí)從解凍的卵巢組織中分離卵泡，放置在配有生長因子、內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢基質(zhì)細(xì)胞的支架中構(gòu)建人工卵巢。人工卵巢移植成功后，卵母細(xì)胞為后續(xù)的生殖過程提供配子，顆粒細(xì)胞和卵泡細(xì)胞提供雌性類固醇激素[9]。

二、人工卵巢的制作過程

1.卵巢組織的獲取及冷凍保存：切除多少卵巢組織主要與未來的治療計(jì)劃和現(xiàn)有的卵巢容積相關(guān)。由于大多數(shù)卵泡位于卵巢皮質(zhì)中，少量的卵巢皮質(zhì)組織足以進(jìn)行生育力保存，但如果患者喪失生育能力的風(fēng)險(xiǎn)很高，冷凍保留整個(gè)卵巢可以確保獲得最大數(shù)量的原始卵泡，為后續(xù)治療提供更多的機(jī)會(huì)[10]。

目前，用于卵巢組織冷凍的方法有程序化慢速冷凍和玻璃化快速冷凍兩種(表1)。關(guān)于卵巢組織低溫保存的最佳技術(shù)還沒有達(dá)成共識(shí)，但是，目前已獲得活產(chǎn)的病例都是采用程序化慢速冷凍保存[11]。研究表明，程序化慢速冷凍在原始卵泡保存、卵泡細(xì)胞增殖、血管生成、抗苗勒管激素表達(dá)和脫氧核糖核酸損傷方面均優(yōu)于玻璃化快速冷凍[12]。但就整個(gè)卵巢而言，冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)、外冰晶的形成，特別是血管內(nèi)冰晶的形成會(huì)破壞器官的結(jié)構(gòu)并損害其功能。冷卻速率也受到冷凍器官尺寸和幾何形狀的限制，冷卻所需的低溫很難在有限時(shí)間內(nèi)均勻地傳遞給所有細(xì)胞，所以，目前還沒有最有效的冷凍保存方案[13]。至今為止，冷凍小塊卵巢組織以防止卵泡丟失和損傷是比較理想的選擇。

表1 程序化慢速冷凍和玻璃化快速冷凍方法比較

2.卵泡的分離和選擇：目前，機(jī)械法、酶法和機(jī)械/酶結(jié)合法廣泛用于從卵巢組織中分離卵泡。其中，機(jī)械法(手動(dòng)攪拌器或手術(shù)刀)分離卵泡能保持卵泡基底膜的完整性但獲卵率相對(duì)較低。酶法獲卵率較高，但卵泡的基底膜損傷，卵泡發(fā)育欠佳。大多數(shù)原始卵泡分布在卵巢皮層纖維中，將機(jī)械法和酶法結(jié)合消化卵巢皮質(zhì)可獲得較高的獲卵率且獲得的卵泡質(zhì)量高，此法在臨床較為常用[8]。目前，形態(tài)正常和顆粒細(xì)胞層完整的存活卵泡的回收率仍然不盡如人意。研究發(fā)現(xiàn)，用Lymphosep分離液進(jìn)行顆粒細(xì)胞分離，使得獲取卵泡更可行，成本更低[14]。惡性腫瘤患者的卵巢組織行卵泡分離時(shí)需重點(diǎn)關(guān)注的問題是惡性細(xì)胞可能污染懸浮液。Soares等[15]設(shè)計(jì)了一種洗滌步驟，將分離的卵泡從一個(gè)液滴轉(zhuǎn)移到另一個(gè)液滴，從而將其與周圍細(xì)胞分離，在分離前66%的卵巢組織和消化的卵巢懸浮液中可檢測到白血病細(xì)胞，分離后所有的卵泡樣本的白血病細(xì)胞檢測結(jié)果均呈陰性。有研究表明，人工卵巢中移植次級(jí)卵泡的卵泡生存率和生長率均優(yōu)于移植原始卵泡[16]。

3.卵巢基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞：卵泡的生存和生長取決于卵泡與周圍卵巢細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的對(duì)話，早期卵泡的發(fā)育是由卵泡和卵巢基質(zhì)的卵巢自分泌/旁分泌調(diào)節(jié)控制的。在原始卵泡激活后，原始卵泡分泌因子從卵巢基質(zhì)招募成纖維細(xì)胞樣前體細(xì)胞或干細(xì)胞并分化成功能細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞的缺乏可能影響卵泡的存活[5]。因此，卵巢基質(zhì)細(xì)胞與人工卵巢的結(jié)合可重建卵泡與周圍基質(zhì)細(xì)胞之間的交互，促進(jìn)卵泡發(fā)育[17]。內(nèi)皮細(xì)胞負(fù)責(zé)卵巢組織的血管重建，運(yùn)輸旁分泌因子、氧和營養(yǎng)物質(zhì)以及去除代謝廢物，提高移植后的血運(yùn)重建有助于多種細(xì)胞的存活。內(nèi)皮細(xì)胞可以在患者完成化療、放療后從新鮮的卵巢活檢組織中分離出來，化療并不影響細(xì)胞行為[18]。聯(lián)合使用新鮮卵巢髓質(zhì)組織的基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞與卵泡聯(lián)合移植，可以提高人工卵巢的效率[18-19]。另外，小鼠脂肪來源干細(xì)胞與早期卵泡的共包埋，有助于顆粒細(xì)胞和卵膜細(xì)胞的功能和存活，促進(jìn)卵泡發(fā)育[20]。

4.人工卵巢的支架：卵泡3D培養(yǎng)采用以生物材料為基礎(chǔ)的支架，對(duì)維持卵泡的球形結(jié)構(gòu)具有重要的作用。生物功能化的3D支架通過維持3D卵泡結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間相互作用和旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)來模擬自然卵巢環(huán)境，誘導(dǎo)卵泡發(fā)育[21]。理想情況下，支架植入后應(yīng)具有生物相容性和可降解性，不影響卵泡的生長和運(yùn)動(dòng)，并通過提供氧氣和營養(yǎng)促進(jìn)新生血管形成[22]。從廣泛的生物材料中選擇一種適合人工卵巢的生物材料是具有挑戰(zhàn)性的。卵巢支架成分依賴于卵泡發(fā)育階段和特異性，該材料必須復(fù)制相應(yīng)的功能性卵泡周圍細(xì)胞外基質(zhì)，并尊重卵巢組織的異質(zhì)性，以保證其生物模擬性[23]。在研究了膠原蛋白、纖維蛋白、血漿凝塊、藻酸鹽、殼聚糖水凝膠、脫細(xì)胞化卵細(xì)胞外基質(zhì)等天然聚合物和合成聚合物如PEG后，提示合成材料在降解率和機(jī)械性能方面更穩(wěn)定[17]，而天然聚合物在細(xì)胞粘附、遷移、增值和分化等方面更有優(yōu)勢，進(jìn)一步通過天然聚合物與合成聚合物相結(jié)合而獲得混合聚合物水凝膠[24]，相關(guān)研究的具體信息見表2。

表2 人工卵巢基質(zhì)材料及相關(guān)研究

三、人工卵巢的植入及監(jiān)測

1.人工卵巢移植部位及注意事項(xiàng)：人工卵巢的移植部位包括原位(盆腔、卵巢、腹膜窗)移植和異位(前臂、頸部、直肌)移植[9]。原位移植在輸卵管保持完整及人工卵巢適當(dāng)定位的情況下可以實(shí)現(xiàn)自然妊娠，而異位移植無法自然妊娠[27]。人工卵巢原位移植為卵泡發(fā)育提供了良好的環(huán)境，有病例報(bào)告證明原位移植是有效的[32]。人工卵巢進(jìn)行異位移植時(shí)，應(yīng)考慮患者的體溫、血壓、旁分泌因素和血液供應(yīng)的差異[33]。異位移植移植過程相對(duì)簡單，重復(fù)移植的成本更低。

人工卵巢移植手術(shù)后面臨的主要問題是免疫排斥反應(yīng)和缺血性損傷。人工卵巢支架生物材料的免疫反應(yīng)仍然是一個(gè)值得注意的問題，支架設(shè)計(jì)應(yīng)考慮緩解免疫反應(yīng)。移植后機(jī)體血管生成和微循環(huán)灌注的時(shí)效性對(duì)人工卵巢的存活和功能恢復(fù)至關(guān)重要[34]。移植后超聲靶向破壞微泡可增加血管生成，通過引起毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷造成短暫的炎癥反應(yīng)來增加血流灌注[35]。圍手術(shù)期使用促紅細(xì)胞生成素可促進(jìn)有效血液運(yùn)輸系統(tǒng)的重建[36]。除此之外，血管生成生物材料、內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮生長因子、維生素E、促性腺激素、褪黑素的使用可能改善人工卵巢的移植結(jié)局[37-38]。

2.評(píng)估與監(jiān)測：在進(jìn)行生育力保存手術(shù)之前，可以通過檢測血清激素水平、B超評(píng)估卵巢體積、竇卵泡數(shù)及卵巢組織活檢等方式評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能。在解凍和移植卵巢組織后，可通過形態(tài)學(xué)評(píng)估和免疫組織化學(xué)了解解凍后和移植后的卵泡情況[38]。當(dāng)人工卵巢應(yīng)用于臨床時(shí)，通過監(jiān)測C-反應(yīng)蛋白水平、CD4/WBC計(jì)數(shù)評(píng)估移植后的炎癥免疫反應(yīng)，通過血清激素水平和超聲成像評(píng)估卵泡發(fā)育情況，通過多光譜光聲層析成像選擇有活力的卵母細(xì)胞[39]。此外，確認(rèn)卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞的遺傳信息在生育力保存過程中沒有被改變非常重要，可在移植前、體內(nèi)成熟和誘導(dǎo)后對(duì)卵母細(xì)胞分別進(jìn)行遺傳信息核對(duì)。

四、人工卵巢的應(yīng)用前景

對(duì)于不能移植解凍卵巢組織的腫瘤患者以及卵巢功能衰竭患者，可以通過移植人工卵巢恢復(fù)生育能力并提高生活質(zhì)量。人工卵巢提供了一個(gè)合適的微環(huán)境來研究卵巢干細(xì)胞，并評(píng)估它們重啟人類配子發(fā)生的能力，也有助于理解卵泡發(fā)生過程。且人工卵巢在毒理學(xué)研究中可以為各類藥物臨床試驗(yàn)提供新的試驗(yàn)體，以闡明不同藥物對(duì)生殖的影響。隨著人工卵巢中卵巢細(xì)胞基質(zhì)的制作技術(shù)發(fā)展，該技術(shù)可以擴(kuò)展到制造其他人工器官。

一般患者自身冷凍卵巢組織的卵泡可以成為配子的來源，而卵巢早衰患者需要采用捐贈(zèng)的卵母細(xì)胞或其他替代來源，各種來源的干細(xì)胞也可成為配子重要的儲(chǔ)備。除了胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，還包括兩種在成年哺乳動(dòng)物卵巢表面上皮中發(fā)現(xiàn)的具有高核質(zhì)比的球形干細(xì)胞：即微小胚胎樣干細(xì)胞和卵巢生殖干細(xì)胞，也可作為卵母細(xì)胞的其他潛在來源[32]。另外，人卵巢卵泡液(human ovarian follicular fluid，HOFF)中含有蛋白質(zhì)、卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞生長和成熟所必需的細(xì)胞外基質(zhì)。上皮細(xì)胞和干細(xì)胞可以從HOFF中分離出來，其在HOFF中的培養(yǎng)時(shí)間延長后，可以觀察到卵母細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，以上結(jié)果證明，從卵泡液中提取的細(xì)胞具有干細(xì)胞特征，這可能有助于再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用和細(xì)胞治療[40]。

五、社會(huì)和生物倫理問題

首先，人工卵巢技術(shù)特殊，且其非常重要的特征是疾病風(fēng)險(xiǎn)不僅涉及患者本人，還涉及子代。卵泡體外操作可能會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞的遺傳和表觀遺傳發(fā)生變化，這將直接影響子代健康。此外，惡性疾病常常是遺傳性的，人工卵巢技術(shù)可能將與惡性腫瘤相關(guān)的遺傳變異傳給下一代，人為增加惡性腫瘤患者的占比[41]。其次，如果將人工卵巢的應(yīng)用范圍擴(kuò)展到非腫瘤患者身上，問題就會(huì)變得更加復(fù)雜，人工卵巢可能成為因職業(yè)或個(gè)人原因而推遲生育的方法，但也可能成為遺傳操縱工具[32]。除此之外，仍有許多問題需要考慮，如人工卵巢技術(shù)是否應(yīng)該有年齡限制？如果患者已經(jīng)有了孩子，是否允許再移植？人工卵巢是否影響患者的身心健康？資源如何合理分配？等等。但不可否認(rèn)的是，人工卵巢技術(shù)的發(fā)展將為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步提供新的思路和方向。

六、小結(jié)

迄今為止，在動(dòng)物研究和人體試驗(yàn)中，人工卵巢可分泌激素并產(chǎn)生卵泡。然而，考慮到其臨床應(yīng)用的遺傳安全性和有效性，還需要優(yōu)化設(shè)計(jì)人工卵巢支架、改良移植技術(shù)以防止術(shù)后缺血，并通過選擇合理的卵巢組織保存方式及更可靠的卵泡分離方法來提高卵泡的復(fù)蘇率。人工卵巢不僅為生育力保存帶來新希望，也為未來人口老齡化提供了新的生育儲(chǔ)備方式；還可能用于瀕臨滅絕物種的保護(hù)，維持生態(tài)多樣性；同時(shí)也可為再生醫(yī)學(xué)提供新的方向。如果未來人工卵巢可以實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用，可能成為組織和器官工程領(lǐng)域新的突破點(diǎn)。