激活的富血小板血漿對卵巢儲備功能降低患者卵丘顆粒細胞凋亡和增殖的影響

朱文倩，張慧敏，李磊，趙明子，郝翠芳*

(1.濱州醫學院，煙臺 264003；2.青島大學附屬婦女兒童醫院，青島 266000；3.青島大學醫學部，青島 266000)

卵巢儲備功能與女性的生殖潛能密切相關，其主要受卵巢內存留的卵泡數量和質量影響。若卵巢內存留的可募集卵泡數目減少、卵母細胞質量下降，導致生育能力降低或出現過早絕經傾向，稱為卵巢儲備功能降低(Diminished Ovarian Reserve，DOR)，臨床表現為月經量少、月經稀發、閉經、不孕等。DOR在女性不孕因素中約占10%[1]，通常受年齡、遺傳、手術、免疫功能異常及環境等因素的影響。DOR女性不僅受孕率低，活產率也很低[2]，常規治療策略有應用促性腺激素釋放激素激動劑、激素替代療法和輔助生殖技術，但治療效果常常不令人滿意，因此改善DOR導致的不孕癥成為生殖領域的一項難題。既往有關DOR的研究主要集中于尋找預測及評估卵巢功能的有效指標[3]，對DOR干預策略研究較少。

富血小板血漿(Platelet-Rich Plasma，PRP)治療對DOR或許是一個很好的選擇。PRP是將動物或人的全血經過離心后得到的富含高濃度血小板的血漿，其血小板及生長因子濃度約為自體血漿的3～5倍，PRP在醫學其他領域已有一些研究及應用[4]。由PRP產生的多種生長因子通過調控多種信號通路影響細胞的分化、增殖等生物學功能[5]。現有研究發現，卵巢內注射PRP可改善DOR患者的激素水平，增加其卵母細胞數量，改善卵巢功能并獲得更好的生育結局[6-7]。

DOR與顆粒細胞凋亡密切相關。既往研究發現顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖的主要原因[8]；且凋亡率越高，出現空卵泡概率越高，卵母細胞和胚胎的質量也越差[9]。一項前瞻性臨床試驗顯示，與卵巢儲備正常的女性相比，DOR女性的顆粒細胞凋亡率顯著增加，且與卵巢反應、卵母細胞產量、MⅡ獲卵數、雙原核(2PN)卵裂數、D3優胚數、囊胚形成率、冷凍胚胎數等參數呈負相關[10]。因此本研究通過體外培養DOR患者卵丘顆粒細胞，探究PRP對DOR患者卵丘顆粒細胞增殖和凋亡的影響，以期為DOR的臨床治療提供依據。

資料與方法

一、研究對象及樣本收集

選取2020年8月至2021年9月在青島婦女兒童醫院生殖醫學中心行常規IVF/ICSI-ET治療的DOR不孕癥患者82例，收集每一例患者的卵丘顆粒細胞，并將所獲細胞平均分為PRP組(使用激活的PRP+培養液培養)和對照組(僅使用培養液培養)，用于后續研究。

DOR目前尚無被臨床廣泛認可且統一的診斷標準，本研究將2011年歐洲人類胚胎與生殖學會發表的卵巢低反應(POR)共識(博洛尼亞共識)中對卵巢儲備功能異常的描述作為本次研究對象的納入標準：血清抗苗勒管激素(AMH)<1.1 ng/ml或基礎竇卵泡計數(AFC)<5～7個[11]；同時體質量指數(BMI)<25 kg/m2、基礎體溫呈雙相型、血清泌乳素水平在正常范圍、受試前6個月未服用過激素類藥物、無卵巢手術史。排除標準：多囊卵巢綜合征患者、子宮內膜異位癥患者、內分泌疾病以及盆腔結核患者。

本研究經青島婦女兒童醫院醫學倫理委員會審查通過，所涉及的患者均已充分告知并簽署知情同意書，且本研究所收集的樣本均為醫療遺棄物，對患者無影響。

二、材料

1.主要試劑和儀器：主要試劑：卵泡刺激素受體(FSHR)抗體(22665-1-AP，Proteintech，美國)；細胞增殖及毒性檢測試劑盒(CCK-8試劑盒)(CA1210，北京索萊寶)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(A111，南京諾唯贊)；凝血酶(來源于牛血漿)(AS00254，Sigma，美國)；血液保存液(威海潔瑞)；DEME-F12培養基(山東思科捷)；RNA快速提取試劑盒(AC0201，山東思科捷)；逆轉錄試劑盒(AG0304，山東思科捷)；SYBR Green qPCR試劑盒(AG11702，湖南艾科瑞)；qRT-PCR引物由北京擎科生物科技有限公司合成，具體信息見表1；Bcl-2抗體(兔，A0208)、Ki-67抗體(兔，A2094)、Bax抗體(兔，A15646)均自武漢愛博泰克；鼠抗山羊IgG二抗(A23410)、兔抗山羊IgG二抗(A23230)購自武漢Abbkine；雌二醇檢測試劑盒(電化學發光法)購自上海羅氏。

主要儀器：Quant StudioTM5實時熒光定量PCR儀(C480，Roche，美國)；熒光顯微鏡(BX51，日本Olympus)；酶聯免疫檢測儀(Bio Tek，美國)；羅氏全自動發光儀(COBAS600，上海羅氏)。

表1 qRT-PCR引物序列

2.細胞株：人卵巢顆粒細胞(KGN細胞)購自中國科學院細胞庫。

三、研究方法

1.人卵丘顆粒細胞的獲取：DOR患者注射HCG扳機后36 h，在超聲引導下經陰道穿刺抽吸直徑≥14 mm的卵泡，對獲取的卵母細胞-卵丘顆粒細胞復合物(COC)機械分割后獲取卵丘顆粒細胞，PBS清洗3遍，使用0.1%的透明質酸酶消化并反復吹打，使細胞團分散為單個細胞。

2.細胞培養：將上述顆粒細胞均分為PRP組和對照組，置于96孔板中于37℃、5%CO2環境中培養。PRP組使用激活的PRP(1%)+含10%胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培養基(共100 μl)培養；對照組僅使用含10%FBS的DMEM-F12培養基(共100 μl)培養。KGN細胞的培養液和培養環境與對照組相同。

3.PRP的制備與激活：征集5名健康成人志愿者，每人采集肘前靜脈全血17.5 ml均分至2支15 ml的離心管(每管含1.25 ml枸櫞酸鈉抗凝劑)，輕輕搖晃混勻。室溫300g離心20 min，小心吸取上層淡黃色部分及上下層連接處部分至新管，300g離心20 min后留取最底層1 ml液體，即PRP。參照之前文獻[12]方法使用PBS將血小板濃度調整為1×109/ml，與10%的CaCl2、凝血酶按9∶1的體積比混勻，于37℃培養箱孵育4 h激活，室溫下2 000g離心10 min，使用0.22 μm過濾器過濾、分裝，凍存于-80℃冰箱備用。

4.CCK-8法測定細胞增殖：使用含有10%FBS的培養基將KGN細胞濃度調整至1×104/ml后均勻接種到96孔板中；PRP濃度梯度設置為0、1%、2%、5%及10%，DMEM-F12培養基中FBS濃度梯度設置為0、2%、5%及10%，每個濃度設置3個復孔，每孔100 μl，于37℃、5%CO2的培養箱中培養，監測0 h、24 h、48 h、72 h、96 h及120 h時的細胞增殖情況。調整人卵丘顆粒細胞濃度至1×104/ml后均勻接種到96孔板中；將PRP濃度梯度設置為0、1%，FBS濃度梯度設置為0、10%，每個濃度設置3個復孔，每孔100 μl，于37℃、5%CO2的培養箱中培養，監測0 h、24 h、48 h、72 h細胞增殖情況。測定時，每孔均加入10 μl CCK-8溶液，在37℃避光孵育2 h，使用酶聯免疫檢測儀檢測450 nm波長處吸光度(OD)值，將僅添加培養液孔的OD值作為對照調零，結果取3孔OD平均值，并以培養時間為橫軸，OD值為縱軸，繪制細胞生長曲線。

5.TUNEL法檢測細胞凋亡：將分組、處理后的人卵丘顆粒細胞分別均勻涂片、標記、固定，按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書處理細胞后于熒光顯微鏡下觀察、拍照。每樣本隨機選取3張圖像，計算TUNEL陽性細胞率(TUNEL染色陽性細胞數/DAPI染色細胞數)并進行統計學分析。

6.qRT-PCR檢測人卵丘顆粒細胞中相關基因表達：使用微量樣品RNA快速提取試劑盒提取樣本RNA，使用逆轉錄試劑盒進行反轉錄。按照SYBR Green qPCR試劑盒說明書完成上樣，使用Quant StudioTM5實時熒光定量PCR儀進行擴增，以GAPDH基因為內參，使用相對定量法檢測Bax和Bcl-2基因的相對表達。實驗數據使用軟件自帶分析工具或按照2-△△CT式進行統計學分析。

7.細胞免疫熒光染色：用胰酶消化細胞5 min，加入完全培養基終止消化，300g離心5 min，吸棄上清后PBS清洗2遍，加入適量多聚甲醛固定，涂片，PBS漂洗后，使用0.5% Triton X-100室溫通透 20 min，PBS漂洗后烘干，滴加山羊血清室溫封閉1 h，后于4℃濕盒過夜孵育一抗(1∶100)。PBS漂洗后，常溫、避光環境下孵育熒光二抗(1∶400)1 h。復染色時使用DAPI或Hoechst避光染色10 min。PBS漂洗后封片，于熒光顯微鏡下觀察、拍照。測定Bax、Bcl-2和Ki-67時每樣本隨機選取3張圖像，使用Image J軟件(NIH，美國)處理，計算平均熒光強度(該區域熒光強度總和/該區域面積)，并進行統計學分析。

FSHR作為特異性表達于顆粒細胞胞質的蛋白，常被用作分子標志物以鑒定顆粒細胞[13]。本研究中顆粒細胞的鑒定即通過細胞免疫熒光法觀察FSHR的表達。

8.E2濃度檢測：備存的PRP組和對照組卵丘顆粒細胞的培養基上清液以300g離心5 min后吸取上清，于青島婦女兒童醫院檢驗科通過羅氏全自動發光儀檢測E2濃度。

四、統計學分析

結 果

一、顆粒細胞的觀察和鑒定

為確定所使用的細胞為顆粒細胞，本研究使用倒置顯微鏡對細胞進行形態學觀察，鏡下可見細胞呈梭形、橢圓形等，表面可見黑色的顆粒狀物質，認為符合顆粒細胞的形態學特征，如圖1A、B所示。

使用細胞免疫熒光法檢測顆粒細胞FSHR的表達，熒光顯微鏡下可見人卵丘顆粒細胞胞質和KGN細胞胞質中有較強熒光，如圖1C示，符合人顆粒細胞的分子特征。

A：KGN細胞不同時間的生長狀態；B：人卵丘顆粒細胞不同時間的生長狀態；C：使用細胞免疫熒光法檢測顆粒細胞中FSHR的表達，可見人卵丘顆粒細胞胞質和KGN細胞胞質中有較強的紅色熒光。圖1 人顆粒細胞的生長狀態及鑒定(×10)

二、不同濃度PRP的顆粒細胞生長情況

為探究體外培養時顆粒細胞生長的最適PRP和FBS濃度，使用CCK-8法檢測KGN細胞在不同PRP、FBS濃度下的生長曲線。結果顯示，適當濃度的PRP可促進細胞增殖(圖2A、B、C、D)。無FBS時，不同濃度的PRP均可促進細胞增殖，其中10%PRP下KGN生長較好(圖2A)；在FBS為2%、5%及10%時，均為加入1%PRP的KGN生長趨勢較好(圖2B、C、D)。不同濃度的FBS和PRP相比，10%FBS+1%PRP的KGN生長最好(圖2D)。隨后我們使用CCK-8法對人卵丘顆粒細胞在不同PRP、FBS濃度下的增殖情況進行檢測，結果大致相同(圖2E、F)。因此選擇10%FBS+1%PRP(即PRP組所用濃度)用于后續實驗。

A：0%FBS時不同濃度的PRP培養KGN的生長曲線，加入PRP后均促進KGN增殖，10%PRP濃度時KGN生長趨勢相對更好；B、C、D：2%、5%、10%FBS時不同濃度的PRP培養KGN的生長曲線，可見1%PRP濃度下KGN生長趨勢較好；圖E、F：0%和10%FBS時不同濃度PRP培養人卵丘顆粒細胞的生長曲線，加入1%PRP均促進人卵丘顆粒細胞增殖，48 h內10%FBS+1%PRP時細胞增殖趨勢最好；與0%PRP比較，*P<0.05。圖2 不同濃度的FBS和PRP下KGN細胞和人卵丘顆粒細胞的生長曲線圖

三、PRP在體外培養中可抑制卵丘顆粒細胞凋亡、促進細胞增殖

為探究PRP對卵丘顆粒細胞凋亡的影響，使用TUNEL法檢測30例DOR患者卵丘顆粒細胞24 h、48 h及72 h時的凋亡情況(每個時間段各10例)。結果顯示，PRP組卵丘顆粒細胞凋亡率(TUNEL陽性細胞率)均顯著低于對照組(P<0.001)(圖3)。

使用qRT-PCR檢測20例DOR患者卵丘顆粒細胞中凋亡相關基因的表達，結果顯示，與對照組相比，PRP組的凋亡基因Bax表達顯著降低，抗凋亡基因Bcl-2表達顯著升高(P<0.01)(圖4)。且30例DOR患者卵丘顆粒細胞的免疫熒光染色(用熒光強度表示蛋白相對表達量)也驗證了這一結果，與對照組相比，PRP組中凋亡蛋白Bax表達量顯著降低(P<0.001)(圖5A)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著升高(P<0.001)(圖5B)。PRP在體外培養中不僅抑制卵丘顆粒細胞的凋亡，還可以促進細胞增殖，除CCK-8法證實PRP可促進顆粒細胞增殖(圖2)外，本研究還對32例DOR患者的卵丘顆粒細胞進行增殖因子Ki-67蛋白的免疫熒光染色，結果顯示，PRP組Ki-67蛋白表達量顯著高于對照組(P<0.001)(圖5C)，再次驗證了PRP促進細胞增殖的作用。

A：24 h、48 h、72 h細胞凋亡免疫熒光成像：TUNEL：TUNEL染色呈紅色；DAPI：細胞核染色呈藍色；Merge：合并圖(凋亡細胞呈粉色)；B：24 h、48 h、72 h對照組和PRP組的TUNEL陽性細胞率(每個時間段各10例)；C：24 h、48 h、72 h對照組和PRP組細胞凋亡率比較(n=10)：與對照組比較，***P<0.001。圖3 TUNEL法檢測DOR患者卵丘顆粒細胞凋亡

A：PRP組和對照組中凋亡基因Bax相對表達量(n=20)，與對照組比較，***P<0.001；B：PRP組和對照組中抗凋亡基因Bcl-2相對表達量(n=20)，與對照組比較，**P<0.01。圖4 qRT-PCR檢測DOR患者卵丘顆粒細胞凋亡相關基因

四、PRP在體外培養中可增強卵丘顆粒細胞的分泌功能

對30例DOR患者卵丘顆粒細胞培養基上清液中的E2濃度進行檢測，結果顯示：與對照組比較，PRP組E2濃度顯著增高(P<0.001)(圖6)。

A：PRP組和對照組凋亡蛋白Bax的表達：左側圖中Bax免疫熒光染色為綠色，細胞核的DAPI染色為藍色；與對照組比較，***P<0.001。B：PRP組和對照組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達：左側圖中Bcl-2免疫熒光染色為粉色，細胞核的DAPI染色為藍色；與對照組比較，***P<0.001。C：PRP組和對照組增殖因子Ki-67的表達：左側圖中Ki-67免疫熒光染色為綠色，細胞核的DAPI染色為藍色；與對照組比較，***P<0.001。圖5 免疫熒光染色法檢測卵丘顆粒細胞中凋亡相關因子與增殖因子的表達

A：PRP組與對照組中E2濃度分布；B：PRP組與對照組中E2濃度比較：與對照組比較，***P<0.001。圖6 羅氏全自動發光儀檢測卵丘顆粒細胞培養基上清液中的E2濃度

討 論

卵巢顆粒細胞包括壁層顆粒細胞和卵丘顆粒細胞，其中卵丘顆粒細胞與卵母細胞關系密切，緊緊圍繞在卵母細胞周圍[14]，影響卵泡的增殖和凋亡[15]。卵丘顆粒細胞與卵母細胞共培養可促進卵母細胞成熟，提高體外受精治療周期中的胚胎著床率和妊娠率[14，16-17]。因此卵丘顆粒細胞的功能與狀態對卵母細胞的生長發育至關重要。

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序死亡，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等，參與卵泡發育的不同階段[18]。DOR患者卵泡的質量和/或數量較正常人顯著降低，既往研究發現DOR患者顆粒細胞的高凋亡是卵泡閉鎖的主要原因[8]，且對生育力有負面影響[9]。

PRP是外周血液離心后獲得的含有高濃度血小板的血漿[5]，激活血小板中的α顆粒會釋放多種生物活性蛋白，包括血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和肝細胞生長因子(HGF)等[5，19]，可刺激細胞的增殖、生長和分化[20]。近年來，PRP治療作為一種新型的治療方法，在其他臨床領域已有較多應用。有研究證明存在于PRP中的骨形態發生蛋白(BMP)、血清生長分化因子(GDF)和激活素可調節多種卵巢功能[21]。例如，在卵泡發生的早期，激活素通過kit配體/c-Kit途徑和smad2/smad3信號通路促進卵母細胞的存活和原始卵泡的形成[22]；BMP7和BMP4可調節原始卵泡的募集，并促進原始卵泡向初級卵泡的轉變[23]；GDF-9對于初級階段后的卵泡生長至關重要，可通過抑制顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖來使卵泡存活[24]。已有一些動物實驗證明，PRP激活后釋放的生長因子在調節卵泡發育過程中起關鍵作用[25]，將PRP直接注射到卵巢治療后的小鼠在卵巢各個階段的卵泡數量及質量都得到了提高[26]，且小鼠卵巢皮質體積增加[27]。臨床上一項前瞻性實驗研究結果顯示，在超聲引導下經陰道在卵巢內注射PRP的DOR患者臨床妊娠率和活產率更高[28]，陳琪琦等[29]對卵巢早衰女性進行經陰道卵巢注射PRP后發現，患者血漿中E2水平較前增加，FSH水平較前降低。多個研究發現經陰道卵巢內注射PRP可以在一定程度上改善患者卵巢功能并成功獲得生育[7，30-31]。因此，本研究通過體外培養DOR患者的卵丘顆粒細胞，給予不同濃度的PRP，探討激活后的PRP對卵丘顆粒細胞凋亡和增殖的影響。因FBS廣泛用于細胞培養，同時也可作為卵母細胞體外成熟卵泡液的替代品[32]，因此本研究在顆粒細胞體外培養時常規給予了FBS。

本研究使用CCK-8法測定并驗證了PRP可促進顆粒細胞增殖的功能，且最適濃度為1%，以該濃度用于后續實驗。將DOR患者的卵丘顆粒細胞分為PRP組和對照組，使用Tunel染色后，發現PRP組患者卵丘顆粒細胞凋亡率顯著低于對照組(P<0.001)；qRT-PCR檢測發現，PRP組中凋亡基因Bax表達顯著低于對照組，抗凋亡基因Bcl-2的表達顯著高于對照組(P<0.001)；使用細胞免疫熒光染色檢測兩組中Bax和Bcl-2的蛋白表達得到了一致的結果，同時增殖因子Ki-67蛋白表達量較對照組顯著升高(P<0.001)；經羅氏全自動發光儀檢測發現，PRP組卵丘顆粒細胞培養基上清液中的E2濃度顯著高于對照組(P<0.001)。上述結果均提示體外細胞實驗中，激活的PRP可抑制DOR患者卵丘顆粒細胞凋亡，促進其增殖，同時增強其分泌功能，使E2水平升高。但本研究尚存在一定的局限性和不足，本研究僅在細胞、RNA、蛋白質層面對PRP的有效性進行了探究，未行動物實驗和機制的探索，后續需進一步的研究和探討。

綜上所述，體外培養人卵丘顆粒細胞時，給予激活的PRP能有效抑制細胞凋亡、促進其增殖，同時增強其分泌功能；這為PRP治療DOR患者的臨床應用提供了一定的理論依據。