弱精子癥和非梗阻性無精子癥患者精漿中miR-106b-5p和miR-202-3p的表達檢測及臨床價值

丁寧，趙銘佳，張瑤楠，韓寶生，劉美玲*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所 男性生殖健康重點實驗室，北京 100081；2.唐山市婦幼保健院生殖遺傳科，唐山 063000；3.北京協和醫學院研究生院，北京 100730)

不孕不育癥是全球性的公共衛生問題，在育齡人群中的發病率約為15%，在所有不孕不育因素中男性因素約占50%[1]。男性不育癥有很多分類，根據病因主要分為：(1)下丘腦垂體功能障礙；(2)睪丸因素；(3)導管阻塞；(4)難以分類的一些其他因素。無精子癥是男性不育中最為嚴重的一種，根據有無梗阻，主要分為梗阻性無精子癥(OA)和非梗阻性無精子癥(NOA)。NOA的發生機制尚不明確，約10%的不育男性和近60%的無精子患者為NOA[2]。弱精子癥是男性不育癥的另一常見原因。弱精子癥定義為精子濃度>15×106/ml而精子前向運動(PR)<32%，這阻礙了精子運動和穿透卵母細胞，影響受精，最終導致不育。目前，男性不育的診斷主要依據WHO推薦的精液參數和睪丸活檢診斷，但這些指標的敏感性和特異性均不十分理想，活檢取材有一定的侵入性，因此探討男性不育的發病機制和發現潛在的無創性分子診斷標志物具有重要的臨床意義。

微小RNAs(miRNAs)是長度為19～25 nt的非編碼RNAs，通過與靶基因mRNA的3′UTR非翻譯區結合，使靶基因mRNA被降解或翻譯過程被抑制[3-4]，繼而在轉錄后水平上發揮調節作用。miRNAs參與多種生命活動，其在哺乳動物精子發生過程中也起著重要作用。研究發現，睪丸中存在高豐度miRNAs，在精子發生和成熟的各個階段均起著重要的調控作用，并且miRNAs的表達或功能異常與男性不育相關[5-6]。文獻報道，miR-106b可能參與生殖細胞分化及減數分裂后雄性生殖細胞功能發育及成熟[3]。與正常男性相比，少精子癥和弱精子癥患者精子的miRNA表達譜存在多個差異表達的miRNAs[7]。本課題組前期研究結果提示，miR-106b-5p具有抑制生精細胞凋亡、促進生精細胞增殖的作用[8]。另有研究發現，miR-202-3p在小鼠睪丸中呈現組織特異性表達，尤其在A型精原細胞中的表達量遠遠高于在粗線期精母細胞和圓形精子細胞，且miR-202-3p在精子發生過程中對精原干細胞維持和自我更新有重要作用[8-9，10]。此外，本課題組利用 Illumina HiSeq X10高通量測序分析NOA患者精漿miRNAs表達譜發現，NOA患者精漿miR-106b-5p和miR-202-3p與正常生育者比較有顯著差異[11]。因此，為了研究精漿miR-106b-5p和miR-202-3p是否對男性不育具有診斷價值，本研究擬采用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測精液參數正常男性、NOA患者和弱精子癥患者精漿中miR-106b-5p和miR-202-3p的表達情況，并繪制受試者工作特征曲線(ROC)，初步探討miR-106b-5p和miR-202-3p對NOA的診斷價值。

資料與方法

一、研究對象

選取2018年12月至2020年10月于唐山市婦幼保健院就診的男性不育癥患者和精液參數正常的志愿者為研究對象。

納入標準：(1)年齡23～44歲；(2)依照WHO診斷標準[12]確診為NOA或弱精子癥；(3)有詳細的病史采集和生殖專科檢查；(4)正常生育男性為男性生殖專科檢查正常且近3年育有健康后代的男性。

排除標準：(1)存在引起男性不育的其他因素如隱睪、尿道下裂、精索靜脈曲張、染色體異常、性腺發育不全等；(2)采樣期間服用過藥物、酗酒、吸煙等。

共納入317例研究對象。根據精液檢查參數和臨床資料不同分為3組：精子濃度>15×106/ml且PR<32%的患者為弱精子癥組(n=106)，NOA癥患者為NOA組(n=92)，同期精液檢查參數正常男性為對照組(n=119)。本研究通過國家衛生健康委科學技術研究所及唐山市婦幼保健院倫理委員會批準，所有受試者均自愿簽署知情同意書。

二、研究方法

1.樣品采集：所有受試者均禁欲3～5 d，手淫法取精，留于無菌的取精杯中，37℃溫育 30 min，液化后于唐山市婦幼保健院實驗室進行精液常規檢查。精液1 500g離心10～15 min去除精子細胞，取上清以11 000 g離心5 min得到精漿，-80℃保存備用。

2.qRT-PCR檢測：采用改良精漿提取法提取各組精漿miRNA[13]。用特異性莖環引物進行反轉錄，合成cDNA，加入SYBR Premix ExTaq(Takara，日本)，進行qRT-PCR反應。反應條件：95℃ 0.5 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環。每個樣本設3個復孔，以DEPC處理的ddH2O作為陰性對照，以U6為內參，miR-106b-5p、miR-202-3p及內參U6的引物均購自蘇州吉瑪有限公司，各引物擴增序列見表1。

表1 qRT-PCR引物擴增序列

三、統計學分析

結 果

一、研究對象的一般資料比較

3組研究對象的平均年齡及體質量指數(BMI)差異均無統計學意義(P>0.05)；NOA組與弱精子癥組患者的不育年限比較亦無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 研究對象的一般資料比較(-±s)

二、3組研究對象精漿中miR-106b-5p和miR-202-3p的表達水平

qRT-PCR檢測結果顯示，NOA組miR-106b-5p的表達水平顯著低于對照組及弱精子癥組(P<0.05)，弱精子癥組miR-106b-5p的表達水平略高于對照組，但差異尚無統計學意義(P>0.05)；NOA組miR-202-3p的表達水平亦顯著低于對照組及弱精子癥組(P<0.05)，弱精子癥組miR-202-3p的表達水平略低于對照組，但差異尚無統計學意義(P>0.05)(圖1)。

A：miR-106b-5p的相對表達量比較；B：miR-202-3p的相對表達量比較。注：與NOA組比較，*P<0.05。圖1 qRT-PCR檢測精漿miR-106b-5p和miR-202-3p的表達情況

三、精漿miR-106b-5p和miR-202-3p對NOA的診斷價值

由前述可知，精漿miR-106b-5p和miR-202-3p在NOA組的表達水平存在顯著差異，推測二者可能對NOA有一定的診斷價值。繪制ROC曲線進行分析后結果顯示，miR-106b-5p的AUC為0.750[95%CI(0.665，0.835)，P<0.000 1]；miR-202-3p的AUC為0.873[95%CI(0.810，0.936)，P<0.000 1]；miR-106b-5p診斷NOA的靈敏度和特異度分別為72.1%和61.2%，miR-202-3p診斷NOA的靈敏度和特異度分別為88.6%和82.9%(圖2，表3)。

圖2 ROC曲線分析

表3 精漿miR-106b-5p和miR-202-3p診斷NOA的靈敏度和特異性

討 論

男性不育作為困擾許多育齡夫婦的難題，給患者帶來巨大心理壓力，且男性不育已成為一個嚴重的健康問題[1]。無精子癥是男性不育中最為嚴重的類型，其中NOA的發病機制相對復雜，且大部分NOA患者病因及發病機制尚不明確，臨床上稱之為特發性無精子癥[12]。弱精子癥是男性不育癥的另一常見原因，其由于精子的運動性差或活力低，阻礙了精子運動和穿透卵母細胞，最終導致不育。目前，睪丸活檢病理學診斷是明確睪丸生精功能的“金標準”，但這些診斷程序伴有一定的侵襲性并可能引起一些并發癥。因此，研究男性不育的病因及致病機理，尋求潛在的無創性分子標志物成為臨床研究的主要挑戰。

精漿miRNAs含量豐富，來源于生殖系統中不同組織及細胞，具有一定的特異性，其通過與蛋白相結合保持性質的相對穩定，因此，選擇miRNAs作為診斷男性不育的無創性分子靶標，具有很好的優勢及前景。精子在睪丸中產生，從精原干細胞(SSCs)經過有絲分裂、減數分裂直到形成成熟精子，這一復雜過程除了受激素和轉錄因子的調控，非編碼RNA(ncRNAs)也在精子發生中發揮作用，其中miRNAs是人類和動物睪丸發育及精子發生過程中的關鍵介質[14-16]。有研究發現，條件性敲除小鼠睪丸生精細胞中的Drosha和Dicer后，小鼠表現為少精子或無精子癥，提示miRNAs參與調節精子發生[16]。還有研究發現，與正常男性精子的miRNA譜相比，弱精子癥患者有27種miRNAs表達下調，50種miRNAs表達上調；少精子癥患者有44種miRNA表達下調，42種miRNAs表達上調[17]。Abu-Halima等[18]研究發現，生精障礙(低生育力和NOA)患者精漿hsa-miR-34b、hsa-miR-34c-5p和hsa-miR-122與男性不育顯著相關。盧新喆等[19]研究發現，復方玄駒聯膠囊聯合常規西醫治療弱精子癥，通過調節精漿miR-106b、抗苗勒管激素(AMH)水平，能有效增強精子活力，提高精子頂體完整率，療效較好。吳彩云等[20]利用Solexa測序技術分別檢測弱精子癥、NOA患者和正常生育男性的精漿miRNAs表達發現，弱精子癥組精漿miR-106b表達水平顯著高于正常生育組，而NOA組miR-106b表達水平顯著低于正常生育組(P<0.05)。本研究結果顯示，NOA組精漿miR-106b-5p的表達水平顯著低于對照組和弱精子癥組(P<0.05)，弱精子癥組精漿miR-106b-5p表達水平略高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；與吳彩云等[20]的研究結果不完全一致，這可能與納入病例間的個體差異有關，今后需進一步擴大樣本量進行驗證。miR-202-3p位于10q26染色體易碎位點，其調控多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡，如胃癌、乳腺癌、宮頸磷狀細胞癌、結直腸癌等[21]。有報道顯示，miR-202-3p在成年男性睪丸組織中高表達[11]，在精子發生過程中發揮著重要的生理功能[9]。此外，在男性生殖系統中，miR-202-3p通過抑制細胞周期因子和RNA結合蛋白來維持小鼠SSCs[21]。本研究結果發現，NOA組患者miR-202-3p的表達水平顯著低于對照組和弱精子癥組(P<0.05)，而弱精子癥組miR-202-3p的表達水平與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。有研究表明，精漿中miRNAs主要來源于精子細胞的釋放[20]，這或許可以解釋本研究中NOA患者精漿中miR-106b-5p和miR-202-3p含量均顯著降低，而弱精子癥患者精漿中miR-106b-5p和miR-202-3p表達量卻無顯著變化的現象。

為了探討精漿miR-106b-5p和miR-202-3p對NOA的診斷價值，進一步繪制ROC曲線顯示，miR-106b-5p和miR-202-3p的ROC-AUC分別為0.750和0.873，二者的ROC-AUC均大于0.7，提示精漿miR-106b-5p和miR-202-3p對NOA的診斷價值較好。

本研究納入的病例數較少，今后應擴大樣本量進一步驗證本研究結果的可靠性。其次，應進一步深入研究miR-106b-5p和miR-202-3p在精子發生過程中的具體分子調控機制，以期為無精子癥的診斷和治療提供理論參考。

綜上所述，不同類型的不育癥患者精漿中miR-106b-5p和miR-202-3p表達具有顯著差異，且ROC曲線結果顯示，精漿miR-106b-5p和miR-202-3p有望成為無創性NOA臨床診斷的標志物，但尚需擴大樣本量進一步驗證本結論。miRNAs在精子發生中起到重要的調控作用，可以為不孕不育的研究和治療提供嶄新的思路；另外，對一些在睪丸組織中特異性表達的miRNAs及其作用機制進行深入研究，可以為避孕研究提供生物學基礎。目前，對于miRNAs在男性生殖健康領域中的調控機制仍然有很多未解之謎，但是隨著研究的不斷展開深入，miRNAs可能成為男性生殖系統疾病診斷和預后分析的新的生物學標志物。