DEHP對青春期雄性小鼠生殖毒性及鐵死亡影響的相關機制

孫镠佳，陳田，丁慧敏，項雨，葛紅山

(1.南京中醫藥大學，南京 210000；2.泰州市人民醫院，泰州 225300)

鄰苯二甲酸(2-乙基己基)二酯[di(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]作為一種常見的增塑劑，能有效提高塑料制品的延展性和柔韌度，因而被廣泛應用于工業、農業、醫療、食品、玩具、建筑等各個領域[1-2]。由于它通常以不牢固的氫鍵與范德華力與塑料基底相連接，在高溫或與疏水材料接觸時極易擴散至大氣、土壤和水體等環境介質，因此極易導致人群廣泛暴露，最終經多種途徑蓄積在生物體內[3-4]。隨著環境檢出率和人群暴露水平的不斷增高，DEHP帶來的生態環境污染和人類健康問題日益受到世界各國的廣泛重視。現有研究顯示，DEHP及其相關代謝物可引起生殖和發育毒性[5-6]、神經毒性[7]、肝毒性[8]、腎毒性[9]、肺毒性[10]、致癌性[11]等多種機體損傷。其中，DEHP對生殖系統的影響，尤其是對雄性生殖的損傷備受關注。目前，已有大量體內外研究對DEHP暴露所致雄性生殖損傷的機制進行探索，主要觀點包括通過干擾下丘腦-垂體-性腺(HPT)軸影響性激素的分泌和調控[12]，破壞機體氧化和抗氧化系統誘導氧化應激[13]等，但結論尚未明確。有研究表明，鐵過載[14]、氧化應激[15]均為誘導雄性生殖損傷的重要機制，而鐵代謝紊亂、脂質過氧化、谷胱甘肽代謝異常又是鐵死亡的主要分子調控機制[16]。基于此，本研究通過不同劑量 DEHP對青春期雄性小鼠進行染毒，觀察其對雄性生殖系統的影響，并進一步探究鐵死亡與DEHP誘導的雄性生殖損傷之間是否存在相關性。

材料與方法

一、實驗動物和材料

1.實驗動物：健康普通級4周齡ICR雄性小鼠24只，購自揚州大學動物實驗中心，動物許可證號為SCXK(蘇)2017-0007。動物實驗室保持溫度(25±1)℃，濕度(60±10)%，光照與黑暗時長比為12 h∶12 h，自由飲水和攝食。

2.主要試劑與儀器：DEHP(上海麥克林生化)，組織鐵測定試劑盒(南京建成生物)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物)。β-actin兔單克隆抗體(4970，Cell Signaling Technology，美國)，轉鐵蛋白(Tf)兔單克隆抗體(T55396，上海艾比瑪特)，轉鐵蛋白受體1(TfR1)兔單克隆抗體(T56618，上海艾比瑪特)，鐵蛋白重鏈1(FTH1)兔單克隆抗體(T55648，上海艾比瑪特)，核因子E2相關因子(Nrf2)兔單克隆抗體(ab62352，Abcam，美國)，谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)兔單克隆抗體(ab125066，Abcam，美國)，溶質載體家族7成員11(SLC7A11)兔多克隆抗體(ab37185，Abcam，美國)，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔二抗(武漢愛博泰克)。全波段多功能酶標儀(BioTek，美國)，低溫超速離心機(Thermo，美國)，XD-202倒置生物顯微鏡(南京江南永新光學)，超聲破碎儀(Newtown CT，美國)。

二、實驗方法

1.動物分組及染毒：24只雄性ICR小鼠經適應性喂養1周后，按體重隨機分為4組，每組6只。參照之前文獻方法[17]，以玉米油為溶劑，分別對各實驗組小鼠給予0.5、50、500 mg/kg的DEHP灌胃染毒(分別為0.5 mg/kg組、50 mg/kg組和500 mg/kg組)，對照組以同劑量玉米油灌胃，1次/d，連續35 d。每天觀察小鼠一般狀態，每周記錄體重1次。于最后一次灌胃24 h后處死小鼠，記錄終體重。

3.精子數量及活力測定：處死小鼠后解剖得到雙側附睪，快速稱重后置于37℃預熱的1 ml生理鹽水中剪碎，繼續37℃水浴5 min，吸管吹打30次制成精子懸液，將濾液滴入精子計數板進行計數。每個樣本觀察3個視野，評估每只小鼠的附睪精子活力。參照文獻方法[18]將精子活動力分為4級：Ⅰ級呈快速直線向前運動，表示精子活動極好；Ⅱ級直線向前運動，表示精子活動較好；Ⅲ級只向前曲線運動，表示精子活動力一般；Ⅳ級只在原地蠕動，表示精子活動能力差。

4.石蠟組織切片及HE染色：新鮮睪丸組織用4%多聚甲醛固定24 h，經常規脫水、透明、浸蠟、包埋后制成組織切片。HE染色后于光鏡下觀察各組睪丸組織形態學改變。

5.睪丸組織鐵含量測定：準確稱取睪丸組織重量，按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下進行機械勻漿，4℃溫度下2 500 r/min離心10 min后取上清液。按組織鐵測定試劑盒說明書操作后用酶標儀于波長520 nm下測定樣品OD值，計算各組睪丸組織的鐵含量。

6. 蛋白免疫印跡法(WB)測定鐵代謝相關蛋白及鐵死亡相關蛋白的表達水平：取各組睪丸組織，用蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)裂解后進行超聲勻漿及低溫離心，提取總蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組蛋白濃度，以40 μg蛋白上樣量進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%)，將目的蛋白分離并轉至PVDF膜(Millipore，美國)。室溫下用快速封閉液(蘇州新賽美生物)封閉10 min，分別加入一抗(Tf、TfR1、FTH1、Nrf2、GPX4、SLC7A11、β-actin)，4℃搖床孵育過夜。次日回收一抗，洗膜3次后加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫搖床孵育2 h，洗膜3次后通過特超敏ECL化學發光試劑盒(上海碧云天生物)曝光顯影。以目的蛋白和內參β-actin條帶灰度值的比值與對照組比較表示目的蛋白的相對表達水平。

三、統計學分析

結 果

一、DEHP對小鼠體重、睪丸重量及臟器系數的影響

DEHP 染毒后，各組小鼠一般情況尚可，均未見明顯異常癥狀。隨著染毒劑量增加，小鼠的染毒后體重及增重量均呈下降趨勢，其中50 mg/kg組的增重量、500 mg/kg 組的染毒后體重及增重量均顯著低于對照組(P均<0.01)；睪丸濕重隨著DEHP染毒劑量增加亦呈下降趨勢，其中500 mg/kg組顯著低于對照組(P<0.01)；各組睪丸臟器系數與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 DEHP暴露對小鼠體重、睪丸濕重及臟器系數的影響[(-±s)，% ]

二、DEHP對小鼠精子數量及質量的影響

與對照組比較，0.5 mg/kg組、50 mg/kg組小鼠附睪精子數量及活力均呈下降趨勢，但尚無統計學意義(P均>0.05)；500 mg/kg組小鼠附睪精子數量及精子活力等級均顯著下降(P<0.05)(表2)。

三、DEHP對小鼠睪丸組織形態學的影響

光鏡下可見對照組睪丸精曲小管排列整齊，層次清楚，結構正常，生精上皮基膜外側可見梭形肌樣細胞精原細胞分布，近腔側可見各級生精細胞依次排列，腔內可見成熟精子(圖1 A)；0.5 mg/kg組睪丸精曲小管排列規則，多層生精細胞正常分布，與對照組未見明顯差別(圖1 B)；50 mg/kg組睪丸精曲小管外形尚規則，但見生精上皮層次減少，排列紊亂，部分生精細胞有脫落現象(圖1 C)；500 mg/kg組睪丸曲精小管形狀不規則，生精上皮嚴重損傷，層次明顯減少，生精細胞排列疏松紊亂，部分細胞脫落游離于管腔(圖1 D)。提示DEHP導致了小鼠睪丸組織的損傷。

表2 DEHP暴露對小鼠精子數量及質量的影響[(-±s)，n(%)]

A：對照組；B：0.5 mg/kg組；C：50 mg/kg組；D：500 mg/kg組。圖1 各組小鼠睪丸的形態學觀察(HE染色，×400)

四、DEHP對小鼠睪丸組織鐵含量的影響

與對照組比較，0.5 mg/kg組、50 mg/kg組小鼠睪丸勻漿中鐵含量均未見明顯差異(P均>0.05)，而500 mg/kg組小鼠睪丸組織鐵含量顯著增加(P<0.05)(圖2)。

注：與對照組比較，*P<0.05。圖2 各組小鼠睪丸組織總鐵含量比較

五、DEHP對小鼠睪丸鐵代謝相關蛋白表達水平的影響

與對照組比較，0.5 mg/kg組、50 mg/kg組小鼠睪丸中的Tf、TfR1及FTH1蛋白表達差異均無統計學意義(P均>0.05)，500 mg/kg組小鼠睪丸中Tf、TfR1的蛋白表達水平均顯著上調，FTH1的表達水平顯著下降(P<0.05)(圖3)。

六、DEHP對小鼠睪丸鐵死亡相關蛋白表達水平的影響

與對照組比較，0.5 mg/kg組、50 mg/kg組小鼠睪丸中的Nrf2、GPX4及SLC7A11蛋白表達水平均無顯著性差異(P均>0.05)；而500 mg/kg組小鼠睪丸中Nrf2、GPX4及SLC7A11蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)(圖4)。

A：WB法檢測小鼠睪丸鐵代謝相關蛋白表達；B：Tf蛋白相對表達量；C：TfR1蛋白相對表達量；D：FTH1蛋白相對表達量。與對照組比較，*P<0.05。圖3 小鼠睪丸鐵代謝相關蛋白表達水平

A：WB法檢測鐵死亡相關蛋白的表達；B：Nrf2蛋白相對表達量；C：GPX4蛋白相對表達量；D：SLC7A11蛋白相對表達量。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 小鼠睪丸鐵死亡相關蛋白表達水平

討 論

DEHP是目前使用最廣泛的鄰苯二甲酸酯類增塑劑之一，作為一種環境內分泌干擾物，其對雄性生殖系統的毒性作用日益受到人們關注。研究表明，DEHP誘導的睪丸損傷是其雄性生殖毒性的主要病理學基礎[19]。睪丸是雄性生殖系統最重要的器官之一，具有合成雄性激素、產生分泌精子等功能，對維持雄性生殖能力至關重要。有研究顯示，母體妊娠期及哺乳期的DEHP暴露可能造成雄性子代附屬生殖結構的發育不良、性激素的異常和睪丸質量的下降[20-22]，而青春期接觸DEHP則可能直接或間接導致雄性大鼠睪丸形態學改變，精子濃度和質量下降以及血清睪丸激素水平的降低[23]。本研究通過給予實驗組0.5、50或500 mg/kg劑量的DEHP建立染毒模型，對青春期短期暴露于不同劑量DEHP所導致的雄性生殖損傷進行討論。本研究結果顯示，雄性小鼠經DEHP染毒后體重和睪丸質量出現下降趨勢，尤其是高劑量(500 mg/kg)DEHP暴露造成雄性小鼠體重及睪丸重量的明顯下降。此外，中、高劑量的DEHP可以誘導小鼠睪丸出現精曲小管結構紊亂、生精上皮變薄等組織病理學改變，精子數量和質量的下降也符合上述結果。然而，對于低劑量(0.5 mg/kg)DEHP組，上述改變均不明顯。以上結果表明，DEHP染毒可以造成睪丸結構及功能的損傷，但可能只有當DEHP劑量足夠大時，這一毒性作用才比較明顯。

鐵死亡(Ferroptosis)是一種鐵依賴的非凋亡形式的程序性細胞死亡，以脂質過氧化物的鐵依賴性積累為特征，最早由Dixon 等[24]于2012年提出。鐵是體內一種具有氧化還原活性的必需微量元素，對維持細胞穩態具有重要作用。循環中的鐵主要以三價鐵離子形式存在，并通過與Tf結合經TfR1進入細胞。進入細胞內的鐵離子還原為二價鐵離子后釋放到細胞質的鐵池發揮作用，過量的鐵則儲存在鐵蛋白(FTL、FTH1)中[25]。據研究表明，鐵積累是鐵死亡發生的必要條件[26]，鐵死亡過程可能伴隨Tf、TfR的升高和鐵蛋白的異常改變。本研究中，高劑量(500 mg/kg)DEHP染毒誘導睪丸組織鐵含量上升，表明DEHP對睪丸鐵穩態產生了影響。進一步對鐵代謝相關蛋白進行檢測，發現500 mg/kg劑量DEHP染毒上調了睪丸組織中Tf、TfR1的蛋白表達水平，而下調了FTH1的表達，通過增加鐵攝入、減少鐵儲存使游離Fe2+在細胞內蓄積。以上結果說明，DEHP染毒可能通過調節睪丸鐵代謝蛋白引起鐵代謝異常。

GPX4途徑是鐵死亡調控的另一重要途徑。GPX4是細胞內最重要的抗脂質過氧化酶，已被證實是鐵死亡的一種負調控因子[27]。GPX4在還原型谷胱甘肽(GSH)的協同作用下將脂質過氧化物轉化為無毒醇類[28]，因此，GSH的耗竭會導致GPX4失活，從而增加細胞內脂質過氧化作用，導致鐵死亡的發生。此外，合成GSH的原料胱氨酸和谷氨酸通過以SLC7A11為主要組成的System Xc-從胞外攝取[29-30]，而Nrf2對SLC7A11水平具有調節作用[31]。因此，System Xc-系統抑制、GPX4活性抑制，均為細胞鐵死亡的重要條件。本研究結果顯示，500 mg/kg組Nrf2及SLC7A11蛋白表達水平均顯著下降，說明System Xc-系統可能被抑制，GSH合成受阻；同時，GPX4蛋白表達水平亦顯著下降，脂質過氧化物清除過程被抑制，可能協同誘導鐵死亡的發生。

綜上所述，本研究就DEHP對雄性生殖毒性及其可能機制進行了初步研究及闡述，結果表明，青春期DEHP暴露能夠導致小鼠出現睪丸組織損傷、生精功能障礙。高劑量染毒小鼠的睪丸組織細胞出現鐵死亡的相關變化：鐵代謝異常及鐵死亡調控基因的異常表達等，提示鐵死亡可能參與了DEHP暴露誘導雄性生殖損傷的病理過程，為DEHP的生殖毒性機制研究開拓了新思路。但本研究各項指標僅限于睪丸水平，缺乏線粒體水平數據；且實驗僅涉及鐵死亡部分相關指標，具有一定局限性，對其研究有待進一步深入和完善。