基于網絡藥理學和分子對接預測金匱腎氣丸治療早發性卵巢功能不全的作用機制

何佳璘，楊麗雅，郭一鳴，亓明康，王含必，王慧萍*

(1.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院婦科內分泌與生殖中心，國家婦產疾病臨床醫學研究中心，北京 100730；3. 國家衛生健康委科學技術研究所，國家衛健委生殖健康工程技術研究中心，北京 100081)

早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性在40歲之前卵巢活動衰退的臨床綜合征，以月經異常(如閉經或稀發月經)伴有高促性腺激素(FSH>25 U/L)和低雌激素為特征[1-2]。POI患者較正常女性有更高的心血管疾病發生率、骨質疏松和骨折風險，且更容易出現認知功能的下降。隨著現代女性生活工作壓力的增加，近年來POI的發病率呈逐年增高的趨勢，據流行病學統計，POI的發病率已由1986年的1%增長到2014年的3.6%[3-4]。POI的病因主要有遺傳性因素、醫源性因素、環境因素、心理因素和免疫因素等[5]。目前最主要的治療方法是激素補充治療，但是因其有增加乳腺癌發生風險等副作用應用受限。中藥作為一種相對安全有效的藥物，為POI提供了另一種治療選擇。金匱腎氣丸記載于張仲景的《金匱要略方論》，主要組成為：附子、桂枝、熟地黃、山藥、山茱萸、茯苓、牡丹皮、澤瀉。金匱腎氣丸補腎化氣，滋腎陰，溫腎陽，臨床有時用于治療女性月經紊亂。本研究應用網絡藥理學方法和分子對接技術[6-7]，探討金匱腎氣丸治療POI的潛在藥物作用機制，為尋找POI新的治療方法提供參考。

材料與方法

一、金匱腎氣丸活性成分與潛在靶點的收集與篩選

使用中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)，以類藥性(DL)≥0.18、口服吸收利用度(OB)≥30%為金匱腎氣丸中各味藥材活性成分的篩選條件，這兩個條件是評價ADME特征(吸收、分布、代謝和排泄)最重要的指標，通過篩選，得到金匱腎氣丸的活性成分。從pubchem網站中獲取活性成分化合物的簡化分子線性輸入系統號(SMILES)，并基于化學相似性原理利用SwissTargetPrediction[8]和SEA數據庫[9]預測藥物靶點。

二、POI靶點篩選

與POI相關的基因通過關鍵詞“premature ovarian insufficiency”從公共數據庫中檢索下載，包括在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM)、Drugbank數據庫和人類基因數據庫(GeneCards)，并進行已有文本挖掘。

三、金匱腎氣丸治療POI關鍵靶點的分析

將活性成分預測靶點與POI的靶基因整合并取交集，得到金匱腎氣丸治療POI的潛在靶點，將所有潛在靶點導入STRING數據庫，得到蛋白質-蛋白質相互作用數據。將所有潛在靶點上傳到Metascape數據庫[10]中，進行基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析。GO分析包括生物學功能分析、分子功能分析和細胞成分分析，KEGG分析可得到金匱腎氣丸治療POI的主要通路；結果均以P<0.05表示差異有統計學意義。

四、網絡構建

利用cytoscape3.7.2軟件構建金匱腎氣丸各藥材-活性成分-潛在靶點網絡，蛋白質-蛋白質相互作用網絡；并使用NetworkAnalyzer計算網絡拓撲學參數進行網絡分析。

五、分子對接

將篩選后的關鍵活性成分和核心靶點進行分子對接驗證，從pubchem數據庫中查詢篩選出的關鍵活性成分的3D結構，從PDB數據庫中下載篩選出核心靶點的3D結構，使用Pymol軟件對蛋白去水去配體加氫，導入Autodock軟件中進行對接尋找最佳對接位點，并將最佳構象導入Pymol進行可視化處理。

結 果

一、金匱腎氣丸活性成分與靶標預測結果

在TCMSP數據庫中共檢索出金匱腎氣丸活性成分102個，包括茯苓活性成分15個，附子活性成分21個，桂枝活性成分7個，牡丹皮活性成分11個，山藥活性成分16個，山茱萸活性成分20個，熟地黃活性成分2個，澤瀉活性成分10個。在SwissTargetPrediction、SEA數據庫中共預測出茯苓活性成分潛在靶點143個，附子活性成分潛在靶點275個，桂枝活性成分潛在靶點62個，牡丹皮活性成分潛在靶點157個，山藥活性成分潛在靶點208個，山茱萸活性成分潛在靶點247個，熟地黃活性成分潛在靶點42個，澤瀉活性成分潛在靶點191個，整理后得到金匱腎氣丸潛在靶點432個。

二、POI靶點和潛在治療靶點篩選

從Drugbank、GeneCards、OMIM中檢索POI，并進行相關文獻文本挖掘，共得到POI相關靶點4 867個，將其中以相關性分數>25分為條件篩選得到的279個靶點與金匱腎氣丸潛在靶點整理取交集后得到金匱腎氣丸治療POI的潛在靶點82個(圖1)。

圖1 金匱腎氣丸各味藥材治療POI潛在靶點Upset圖

三、GO和KEGG富集分析結果

將篩選得到的金匱腎氣丸治療POI的潛在靶點導入Metascape數據庫中進行GO和KEGG分析，最終得到1 805條GO條目和263條KEGG條目，其中得到1 636條生物過程條目，主要富集在正向調整激酶活性、腺體發育、細胞對激素刺激的反應、生殖結構的發育等方面；62條細胞組分條目，主要富集在受體復合物、膜筏、轉移酶復合物等方面；107條分子功能條目，主要富集在蛋白激酶活性、細胞因子受體結合、核受體活性等方面；263條通路條目，主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、缺氧誘導因子-1(HIF-1)、腫瘤轉化相關蛋白53(P53)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)、轉化生長因子-β(TGF-β)等信號通路上。按照顯著水平P值從小到大排列，GO分析結果分別選取生物過程、細胞組分、分子功能前10條繪制柱狀圖(圖2)，KEGG分析結果選取前20條繪制氣泡圖(圖3)。

BP：生物過程；CC：細胞組分；MF：分子功能。圖2 金匱腎氣丸治療POI潛在靶點GO富集分析

圖3 金匱腎氣丸治療POI潛在靶點KEGG富集分析

四、金匱腎氣丸治療POI潛在靶點的網絡構建及網絡拓撲分析

使用cytoscape3.7.2軟件構建金匱腎氣丸各藥材-活性成分-潛在靶點網絡(圖4)，其中紅色節點為金匱腎氣丸藥材成分如茯苓、附子等，黃色節點為金匱腎氣丸藥材活性成分如胡椒堿、薯蕷皂苷元等，藍色節點為金匱腎氣丸治療POI的潛在活性靶點如雌激素受體等。將獲得的金匱腎氣丸治療POI的潛在靶點導入STRING數據庫中，并將交互信息繪制蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖(PPI圖，圖5)，利用NetworkAnalyzer進行兩個網絡拓撲學分析，計算得到網絡中平均最短路徑、介數和自由度。具有較小平均最短路徑、較大介數或較大自由度的節點視為網絡中的重要靶點，圖5中節點顏色隨自由度值變化，顏色越紅節點越重要。為綜合考慮平均最短路徑和介數，引入R值用于評估靶點的重要性，R值越小靶點越重要(表1)。最終確定PPI網絡(圖5)中R值越小且自由度為平均自由度2倍以上的蛋白靶點：雌激素受體α(ESR1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)為核心蛋白靶點；藥材-活性成分-潛在靶點網絡(圖4)中自由度為平均自由度2倍以上的靶點：薯蕷皂苷元、澤瀉醇B、羥基芫花素、去氧穿心蓮內酯、胡椒堿、槲皮素為核心活性成分靶點。

圖4 金匱腎氣丸藥材-活性成分-潛在靶點網絡

圖5 金匱腎氣丸治療POI潛在靶點PPI圖

續表

續表

五、分子對接結果

利用分子對接技術對網絡藥理學結果進行進一步驗證，將網絡中篩選出的金匱腎氣丸治療POI的核心活性成分和核心靶點進行分子對接，結合能越低則核心活性成分與核心靶點的結合力越強，一般認為結合能≤-5.0 KJ/mol的核心活性成分與蛋白分子結合較好。根據結合能繪制熱圖(圖6)，顏色越深表示結合能越低、結合力越強。將結合能≤-5.0 KJ/mol的構象進行可視化(圖7)，結果顯示薯蕷皂苷元與ESR1、VEGFA、AKT1，澤瀉醇B與ESR1、AKT1，羥基芫花素與ESR1，胡椒堿與ESR1具有較強的結合力。

圖6 金匱腎氣丸治療POI的核心活性成分和核心靶點結合能熱圖

圖7 金匱腎氣丸治療POI的核心活性成分與核心靶點的分子對接圖

討 論

目前POI的治療包括激素替代治療、干細胞移植、中藥治療等多種方式，對于緩解癥狀有一定效果，但仍存在一定的局限性。以激素替代治療為例，該治療方法除了可能增加乳腺癌發生風險外，還存在多種應用禁忌證和慎用情況，如惡性腫瘤、血栓性疾病、子宮肌瘤、內膜增生和糖尿病、高血壓、肝功能障礙等；且目前仍缺乏其對POI患者死亡率影響的長期前瞻性研究。而干細胞治療、中醫藥方法則存在療效不確切、沒有規模性研究數據證實的問題，因此，探索POI更有效的治療方法具有重要的意義。

網絡藥理學以系統生物學理論為基礎對生物系統進行網絡分析，選取特定信號節點開展多靶點藥物分子設計、系統闡述機體與藥物相互作用的原理和規律。它從“一標一靶”模式向“多靶點、多組分”模式轉變的特點與復雜疾病涉及到機體調控網絡中多個基因和信號通路的特點相吻合，其系統性和廣泛性的視角，在揭示復雜配方的內在機制方面具有優勢。網絡藥理學已經從篩選中藥中的有效成分發展到揭示中藥組分治療疾病的相關途徑及靶點、剖析方劑配伍規律以探討更為科學的方劑可能性，在新藥研發和現有藥物的再利用中具有極大的價值[11]。

金匱腎氣丸，最早出自《金匱要略》，有“補腎諸方之祖”之稱，由茯苓、附子、桂枝、牡丹皮、山藥、山茱萸、熟地黃、澤瀉組成，廣泛應用于生殖功能減退、弱精子癥等生殖系統疾病[12]。金匱腎氣丸可通過調節雌二醇(E2)等激素水平改善腎陽虧虛狀態[13]，臨床上常用于治療內分泌失調等POI相關癥狀。受生殖系統和中藥本身特點的限制，生殖相關疾病的中藥應用發展緩慢，網絡藥理學的引入，有助于探索潛在的藥物新靶點和相關信號通路，進一步了解藥物作用機制[11]。目前，有學者通過網絡藥理學對歸腎丸、左歸丸等治療POI的機制進行研究[14-15]，但尚未檢索到應用網絡藥理學探討金匱腎氣丸治療POI相關機制的研究。因此，本研究運用網絡藥理學和分子對接技術，通過數據挖掘、網絡構建、網絡拓撲學結構分析，預測金匱腎氣丸治療POI的作用機制，為進一步尋找治療POI的新藥提供實驗依據。

實驗篩選后得到金匱腎氣丸治療POI的潛在靶點82個，選取金匱腎氣丸藥材-活性成分-潛在靶點網絡中節點自由度為平均自由度2倍以上的活性成分為核心成分，即治療POI的核心活性成分包括薯蕷皂苷元、澤瀉醇B、羥基芫花素、去氧穿心蓮內酯、胡椒堿、槲皮素。選取PPI網絡圖中R值靠前且網絡中節點自由度為平均自由度2倍以上的節點為核心靶點，即ESR1、VEGFA、AKT1為核心靶點。

薯蕷皂苷元是一種植物甾體皂苷元，與雌激素有獨特的結構相似性，可促進性激素、皮質激素等甾體類激素的生物合成[16]。羥基芫花素具有抗氧化作用[17]，去氧穿心蓮內酯和胡椒堿具有抗炎和氧化應激作用[18-19]。槲皮素能在一定程度上促進各級卵泡發育，增加雌激素分泌，改善卵巢功能[20]；還可以提高卵母細胞和胚胎質量，影響顆粒細胞的增殖和凋亡，降低氧化應激[21]。ESR1主要在卵泡膜上表達，與雌激素結合發揮相應生物學效應。VEGFA是血管內皮生長因子(VEGF)家族中的一員，卵巢濾泡的發育依賴血管生成，尤其是VEGF驅動的血管生長。有研究表明，VEGFA亞型的平衡控制著卵泡的進展和黃體生成，亞型的表達還可以調節哺乳動物的生育能力[22]。AKT1是PI3K-Akt通路的重要蛋白分子，有研究表明AKT過度活化后會導致原始卵泡過度活化和POI[23]。

富集分析結果表明，金匱腎氣丸治療POI的機制可能與PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、P53、PPAR、TGF-β等信號通路，正向調整激酶活性、腺體發育、細胞對激素刺激的反應、生殖結構的發育等生物過程相關。其中，PI3K-Akt信號通路作為POI相關信號通路被廣泛研究，其下游的信號分子中，叉頭轉錄因子O3(FoxO3a)在卵泡生長的初始階段能抑制卵泡活化，FoxO3a基因敲除小鼠因整體卵泡激活導致卵母細胞死亡、早期功能性卵泡衰竭和繼發性不孕[24]。哺乳動物中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性升高會激活原始卵泡池，從而導致早期卵泡衰竭，引起POI[25]。還有研究表明，AKT激酶可以調節天然免疫細胞(中性粒細胞、巨噬細胞、樹突細胞)的發育和功能[26]。MAPK通路可能參與調控卵巢顆粒細胞的細胞周期、增殖和凋亡等過程[27]。HIF-1α的表達量能反應卵巢儲備功能，是POI的預測指標之一[28]。P53信號通路的激活可能誘導卵巢組織的凋亡，最終導致POI[29]。PPAR信號通路可能與卵泡發育和調節雌激素分泌有關[30]。TGF-β信號通路能增強FSH刺激的孕酮生成和黃體生成素受體表達，從而促進卵泡存活[31]。正常卵巢功能的維持是一個復雜的過程，上述信號通路在其中均發揮重要作用，然而通路與通路之間的關聯、核心的啟動因子尚未研究明確。

我們將篩選出的金匱腎氣丸中的核心活性成分和POI發病的核心靶點分別進行分子對接，進一步驗證兩者的結合活性，結果顯示，薯蕷皂苷元與ESR1、VEGFA、AKT1，澤瀉醇B與ESR1、AKT1，羥基芫花素與ESR1，胡椒堿和ESR1具有較強的結合力。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學和分子對接技術預測金匱腎氣丸治療POI的作用機制，結果顯示金匱腎氣丸中的薯蕷皂苷元、澤瀉醇B、羥基芫花素、去氧穿心蓮內酯、胡椒堿、槲皮素等核心活性成分可能作用于ESR1、VEGFA、AKT1等核心靶點，通過PI3K-Akt、MAPK、HIF-1等信號通路介導細胞生長、增殖、分化、衰老和凋亡，通過抗炎、抗氧化、調節激素合成與分泌等作用發揮治療作用。但是本研究目前還處在理論層面的預測階段，接下來還需進一步的動物實驗驗證，以期為POI的中藥治療提供更多參考。