ERK1/2信號蛋白和蛋白降解酶在骨關節炎患者軟骨/軟骨下骨中的表達及其意義

蒲沛東，馬騰洋，周士平，張賽，韓飛，馬青源，王超，王維山*

1石河子大學醫學院第一附屬醫院骨科中心，新疆石河子 832000；2解放軍69337部隊衛生隊，新疆塔城 834600；3解放軍69245部隊醫院骨科，烏魯木齊 830000；4解放軍32330部隊衛生隊，烏魯木齊 830000

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種以不同程度的關節疼痛、僵硬、功能障礙和畸形為特征的慢性退行性關節病[1-2]。OA特征性病理改變為軟骨降解與軟骨下骨代謝紊亂[3]。研究發現，軟骨降解和軟骨下骨改變與OA發展存在內在聯系[4-5]，但由于目前對OA病變的認識不足，尚無有效的方法阻止OA的進展。軟骨降解和軟骨下骨代謝改變共同促進OA的發生發展，因此探討導致二者共同信號的通路及蛋白水解酶的作用對調控和阻止疾病進展可能具有重要意義。細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal regulated kinases 1/2，ERK1/2)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)家族的一員，對骨和軟骨的正常生長發育及代謝起著重要的調控作用，且在OA中呈高表達[6]。蛋白降解酶是一類催化多肽或蛋白水解的酶，可降解軟骨基質使軟骨發生退變，降低關節的穩定性，促進OA的發生[7]，尤其以基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)[8]和聚蛋白多糖酶(Aggrecanase)目前研究最多且發揮作用最為顯著。研究發現，尿激酶型纖溶酶激活物(urokinase type plasmin activator，uPA)激活后，MMP-3即可發揮較強的軟骨基質降解作用，且可與激活的MMP-9發揮較強的級聯放大作用，從而促進軟骨降解[9-10]。本課題組前期對OA臨床標本進行研究發現，軟骨/軟骨下骨中的MMPs不僅參與軟骨降解，還在軟骨下骨代謝過程中發揮作用[11]。聚蛋白多糖酶是帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整連蛋白金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTs)家族成員，能與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)結合并參與其代謝過程[12]。在小鼠模型中已經證實，敲除ADAMT5基因可抑制OA和炎癥性關節炎的發生發展[13]，由此可見，ADAMT5在OA病變中發揮重要作用。軟骨下骨位于軟骨與骨組織之間，其改變是OA發生機制的重要組成部分[14-15]，因此對軟骨下骨微結構進行研究也可為探討OA病變機制提供新的依據。本研究探討了ERK1/2信號蛋白與OA致病相關蛋白降解酶在軟骨/軟骨下骨中的表達及其意義，以期為OA的早期診斷及治療提供新的方法與思路。

1 資料與方法

1.1 試劑及儀器 ERK1/2、pERK1/2、MMP-3、MMP-9、ADAMT5一抗購自英國Abcam公司；山羊抗兔IgG二抗購自美國Sigma公司；QuantiNova SYBR Green PCR Kit (500)購自德國QIAGEN GmbH公司；SDS-PAGE Gel Kit購自北京Solarbio科技有限公司；Trizol試劑和SuperScriptFirst-Strand Synthesis System反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。PCR擴增儀(AG 22331 Hambrug)購自德國Eppendorf Corporation公司；紫外分光光度儀購自北京Tiangen公司。

1.2 組織標本 收集2017年12月－2019年12月于石河子大學醫學院第一附屬醫院關節外科住院的明確診斷為OA并行全膝關節置換術的50例患者的膝關節脛骨平臺樣本及創傷科因外傷截肢的10例患者(無任何形式的關節疾病)的健康膝關節脛骨平臺樣本(作為對照)。50例OA患者中，男24例，女26例，年齡(69.3±5.2)歲。10例截肢患者中，男6例，女4例，年齡(56.1±4.4)歲。根據OARSI-Modified Manking評分及病變程度將所有標本分為對照組、輕度組(OARSI-Modified評分1～15分，Manking評分1～9分)及重度組(OARSI-Modified評分16～24分，Manking評分10～14分)。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究經石河子大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準(2017-119-01)。

1.3 納入和排除標準 參照2014年國際骨關節炎研究協會制定的膝關節OA診斷標準，在排除類風濕關節炎、腫瘤性疾病及創傷的情況下，符合以下1+2條、1+3+5+6條或1+4+5+6條即可診斷為OA。(1)患者自覺膝關節有疼痛感；(2)膝關節負重位X線片顯示膝關節關節間隙變窄、不對稱，關節軟骨硬化增生，并有骨贅，在硬化的關節軟骨下方出現囊性改變；(3)完成關節液實驗室檢查2次，檢查結果符合OA診斷標準：關節液清亮，黏稠度正常，淡黃色，同時炎性指標如紅細胞沉降率(ESR)及C反應蛋白處于正常范圍；(4)膝關節活動度尚且存在，沒有關節強直等表現；(5)年齡≥40歲；(6)關節活動時具有骨擦音或感覺到骨擦感。

對照組排除有膝關節創傷史、其他形式的關節炎、代謝性骨病、骨腫瘤或者服用影響骨重塑的藥物者，以及未包含足夠的軟骨下骨脛骨平臺(軟骨下骨板和軟骨下小梁骨的總厚度＜5 mm)者。

1.4 HE染色觀察軟骨退變情況及破壞程度 脛骨平臺組織切片經二甲苯脫蠟、乙醇水化后，于37 ℃恒溫0.4%胃蛋白酶溶液中修復30 min；PBS漂洗3次，滴加3%過氧化氫修復30 min；PBS漂洗3次，5%胎牛血清封閉30 min。蘇木精復染30 s、1%鹽酸酒精酸化3～5 s后沖洗，返藍10 min；PBS漂洗3次，經95%乙醇清洗、無水乙醇脫水、二甲苯透明后，光學樹脂封片。其中細胞核呈紫藍色，軟骨基質呈藍色。顯微鏡下觀察軟骨細胞數量及染色深度并進行OARSI評分。OARSI評分標準：(1)6個等級。1級關節軟骨表面尚完整；2級關節軟骨表面不連續，在中層軟骨區域伴隨出現細胞增殖；3級軟骨表面可見垂直裂紋，其深度可達中層軟骨；4級出現軟骨侵蝕，軟骨基質丟失；5級鈣化軟骨層或軟骨下骨完全暴露；6級關節變形及微骨折，有骨贅形成。(2)4個階段。階段1指受累關節軟骨小于整個軟骨表面的10%，階段2指受累關節軟骨占整個軟骨表面的10%～25%，階段3指受累關節軟骨占整個軟骨表面的25%～50%，階段4指受累關節軟骨范圍達到整個軟骨表面的50%及以上。等級和階段相乘后得到軟骨破壞程度的最終評分，評分越高表明關節軟骨破壞程度越重。

1.5 免疫組化染色檢測ERK1/2、pERK1/2、MMP-3、MMP-9、ADAMT5的表達情況 脛骨平臺組織切片經二甲苯脫蠟、乙醇水化后，于0.4%胃蛋白酶溶液中置于37 ℃恒溫箱靜置修復30 min；PBS漂洗3次，滴加3%過氧化氫修復30 min；PBS漂洗3次，5%胎牛血清封閉液封閉30 min；滴加ERK1/2(1:50)、pERK1/2(1:200)、MMP-3(1:100)、MMP-9(1:100)、ADAMT5(1:50)一抗4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3次；滴加山羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育30 min；DAB顯色后沖洗，經蘇木精復染30 s、1%鹽酸酒精酸化3～5 s、沖洗至無顏色后，返藍10 min；清洗及脫水后光學樹脂封片。顯微鏡下計數陽性細胞數及著色強度來判斷陽性強度。判斷標準：陽性細胞數百分比＜5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%、75%～100%，分別計0、1、2、3、4分；著色強度為無著色、淺棕黃色、棕黃色、棕褐色，分別計0、1、2、3分。由兩項評分相乘獲得最終積分，0～1、2～4、5～8、9～12分分別評定為-、+、++、+++，其中-為陰性，+為弱陽性，++/+++為強陽性。

1.6 Western blotting檢測ERK1/2、pERK1/2、MMP-3、MMP-9、ADAMT5蛋白的表達 將脛骨平臺組織樣品研磨成粉狀收集到1.5 ml EP管中，加入1 ml RIPA及蛋白酶抑制劑，4 ℃孵育過夜；勻漿90 min，4 ℃下12 000 r/min離心30 min，取上清，分裝于EP管中。使用紫外分光光度計測定蛋白質濃度，然后向EP管中加入1/4的Loading Buffer煮沸10 min，于-80 ℃保存備用。電泳轉膜后將PVDF膜置于5% BSA中室溫封閉2 h，于搖床上用TBST洗膜5 min×3次，滴加一抗4 ℃孵育過夜；TBST漂洗3次，滴加二抗室溫孵育2 h。TBST漂洗3次，洗膜后顯影，根據內參條帶灰度值調整上樣量。實驗重復10次。

1.7 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測ERK1/2、MMP-3、MMP-9、ADAMT5mRNA的表達 采用QIAGEN試劑盒和Trizol試劑提取脛骨平臺組織總RNA，使用SuperScriptFirst-Strand Synthesis System反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，行RT-qPCR檢測。反應體系20 μl：SYBR GreenMaster PCR Mix 10 μl、DPEC水5 μl、上下游引物各1 μl、Rox 2 μl及cDNA 1 μl。反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法分析ERK1/2、MMP-3、MMP-9和ADAMT5mRNA相對表達水平。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-qPCR

1.8 Micro-CT掃描分析軟骨下骨的厚度 沿長軸掃描標本(掃描精度：18 μm；過濾器：0.5 ml Al)，180°螺旋掃描(電壓60 kV，電流368 μA)，重建圖像數據后觀察冠狀、矢狀和橫斷面結構。經3D重建后，選擇人類脛骨平臺中軟骨下骨的感興趣區(ROI，9 mm×9 mm×5 mm，垂直于關節表面)，測量ROI的骨礦物質密度(BMD)、骨體積分數(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數量(Tb.N)及骨小梁間距(Tb.Sp)。

1.9 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用非參數檢驗；計數資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 OA脛骨平臺標本大體形態 如圖1所示，OA脛骨平臺外側面的關節軟骨輕度磨損，軟骨表面相對完整；內側平臺表面不均勻，關節受力的區域和嚴重磨損的區域有軟骨剝脫跡象，表面骨贅增生，可見軟骨下骨裸露和軟骨下骨鈣化。

圖1 OA脛骨平臺大體觀察Fig.1 Gross observation of knee OA and tibial plateau

2.2 各組軟骨退變情況及破壞程度 根據OARSIModified Manking評分，50例OA患者中，輕度組31例，重度組19例。HE染色結果顯示，對照組軟骨表面完整無磨損，未見硬化軟骨，未見暴露的軟骨下骨；輕度組軟骨變薄，軟骨細胞層次排列不清，軟骨下骨厚度增加，軟骨表面不均勻且有深達軟骨下骨的裂縫；重度組軟骨幾乎完全消失，軟骨下骨明顯暴露并變形，鈣化軟骨增厚，軟骨下骨區骨細胞減少、骨小梁增粗，骨小梁排列紊亂(圖2)。OARSI評分結果顯示，與對照組相比，輕度組、重度組OARSI評分明顯升高[(8.14±0.56)分、(23.33±0.17)分vs. (3.53±0.11)分，P＜0.05]，且重度組高于輕度組，差異有統計學意義(P＜0.05，圖2)。

圖2 各組軟骨退變情況及破壞程度(HE染色，n=10)Fig.2 Degeneration and damage degree of cartilage in each group (HE staining, n=10)

2.3 各組軟骨下骨中ERK1/2、pERK1/2表達情況 免疫組化染色結果顯示，與對照組比較，輕度組和重度組軟骨下骨中pERK1/2多為高度表達(χ2=65.618，P＜0.001)，特別是在軟骨下骨靠近軟骨區域，但各組ERK1/2表達情況無明顯差異(圖3A)。Western blotting檢測結果顯示，與對照組相比，輕度組和重度組軟骨下骨中pERK1/2蛋白表達水平升高(0.42±0.03、0.51±0.07vs. 0.21±0.05，P＜0.05)，且重度組高于輕度組(P＜0.05，圖3B)。RT-qPCR檢測結果顯示，各組ERK1/2mRNA表達水平無明顯差異(P＞0.05，圖3C)。

圖3 各組軟骨下骨中ERK1/2、pERK1/2表達情況Fig.3 Expression of ERK1/2 and pERK1/2 in subchondral bone of each group

2.4 各組軟骨/軟骨下骨中MMP-3、MMP-9和ADAMT5蛋白和mRNA表達情況 免疫組化染色結果顯示，與對照組比較，輕度組和重度組軟骨/軟骨下骨中MMP-3、MMP-9和ADAMT5表達水平明顯升高(χ2=43.927，P＜0.001，n=47)，且重度組高于輕度組，差異有統計學意義(P＜0.05，圖4A)。

Western blotting檢測結果顯示，與對照組比較，輕度組和重度組軟骨/軟骨下骨中MMP-3(0.43±0.04、0.57±0.04vs. 0.14±0.08，P＜0.001)、MMP-9(0.32±0.06、0.46±0.03vs. 0.12±0.05，P＜0.01)、ADAMT5(0.62±0.01、0.85±0.06vs.0.24±0.04，P＜0.05)蛋白表達水平升高，且重度組高于輕度組，差異有統計學意義(P＜0.05，圖4B)。

RT-PCR檢測結果顯示，與對照組比較，輕度組和重度組軟骨/軟骨下骨中MMP-3(30.44±0.47、108.82±0.11vs. 1.00±0.08，P＜0.05)、MMP-9(5.63±0.31、36.94±0.24vs. 1.00±0.10，P＜0.05)、ADAMT5(18.09±0.38、93.52±0.61vs. 1.06±0.09，P＜0.05) mRNA相對表達水平升高，且重度組高于輕度組，差異有統計學意義(P＜0.05，圖4C)。

圖4 MMP-3、MMP-9和ADAMT5蛋白和mRNA在軟骨/軟骨下骨中的表達情況Fig.4 Expression of MMP-3, MMP-9 and ADAMT5 protein and mRNA in cartilage and subchondral bone

2.5 Micro-CT對軟骨下骨微結構改變的鑒定情況

Micro-CT掃描顯示，對照組軟骨厚度正常，骨小梁排列稀疏無增粗，相互連接呈拱橋狀；輕度組和重度組中軟骨厚度降低，軟骨下骨骨小梁排列紊亂，小梁厚度增加，間隙變窄，相互連接呈現為厚板狀。與對照組比較，輕度組和重度組軟骨/軟骨下骨中BV/TV、Tb.Th、Tb.N、BMD明顯增高，Tb.Sp明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05，圖5、表2)。

表2 各組軟骨下骨感興趣區域BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、BMD比較(±s)Tab.2 Comparison of subchondral bone regions of interest BV/TV, Tb.Th, Tb.N, Tb.Sp and BMD in each group (±s)

表2 各組軟骨下骨感興趣區域BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、BMD比較(±s)Tab.2 Comparison of subchondral bone regions of interest BV/TV, Tb.Th, Tb.N, Tb.Sp and BMD in each group (±s)

BV/TV. 骨體積分數；Tb.Th. 骨小梁厚度；Tb.N. 骨小梁數量；Tb.Sp. 骨小梁間距；BMD. 骨密度；與對照組比較，(1)P＜0.05；與輕度組比較，(2)P＜0.05

參數 對照組(n=10)輕度組(n=19)重度組(n=31) P BV/TV 0.08±0.02 0.75±0.09(1) 0.81±0.05(1)(2) 0.003 Tb.Th(mm) 0.06±0.02 0.22±0.07(1) 0.22±0.06(1) 0.024 Tb.N(1/mm) 0.85±0.11 4.32±0.73(1) 3.45±0.79(1)(2) 0.013 Tb.Sp(mm) 0.81±0.29 0.06±0.01(1) 0.05±0.01(1) 0.046 BMD(mg/cm2) 25.49±2.19 502.25±24.69(1) 549.49±17.79(1)(2) 0.005

圖5 各組軟骨下骨感興趣區域micro-CT掃描冠狀面圖像Fig.5 Micro CT scanning coronal images of regions of subchondral bone regions interest in each group

3 討 論

MAPK可介導多種細胞凋亡[16]，調控成骨細胞和軟骨細胞的分化及增殖。越來越多的證據表明，MAPK的激活在OA病理改變中發揮主導作用，主要通過刺激軟骨細胞[17]和成骨細胞[18]的分化及增殖來誘導MMPs的表達。ERK1/2信號通路是MAPK最為重要的激活途徑，與軟骨基質降解及軟骨細胞肥大分化有關[19]。研究發現，通過抑制IL-1β來誘導ERK途徑的激活可延緩OA的進展[20]，與靶向抑制MAPK通路(特別是抑制ERK1/2信號通路)的作用一致[21]，且該作用在骨性關節炎動物模型中也得到證實[22]。目前對ERK1/2信號通路在人軟骨/軟骨下骨中表達的研究較少，為此本研究對人OA脛骨平臺標本進行分析，發現軟骨/軟骨下骨中ERK1/2的磷酸化增加且與病變程度呈正相關，與Prasadam等[23]在OA軟骨細胞層面的研究結果相符。趙晉等[24]在體外實驗中證實，軟骨下骨層面pERK1/2信號蛋白發生了改變，但不同退變程度關節中ERK1/2蛋白和mRNA的表達差異并不明顯。

MMP-3又稱間充質裂解酶[25]，在OA患者的軟骨、滑膜、滑液和外周血中呈高表達[26]，其作用為降解軟骨基質。MMP-9又稱明膠酶[27]，目前已有研究證實其在OA軟骨組織中呈高表達[28]。β-連環蛋白可誘導軟骨細胞中MMP-9高表達[29]，從而導致小鼠膝關節OA的發生，由此推測，MMP-9在軟骨下骨中也呈高表達，本研究證實了這一推測。越來越多的證據表明，ERK激活后可介導MMPs的產生，從而促進軟骨降解[30-31]。軟骨降解與軟骨/軟骨下骨的相互作用有關，且MMPs在軟骨/軟骨下骨中的表達增加也促進了兩者的相互作用。本研究檢測了人OA脛骨平臺標本軟骨/軟骨下骨中ERK1/2及pERK1/2的表達，發現pERK1/2表達增加，且同一區域中MMP-3和MMP-9也呈高表達，由此推測，軟骨下骨中ERK1/2信號通路的激活可能會促進MMPs的合成增加，最終導致軟骨和軟骨下骨相互作用增強并發生軟骨降解。ADAMT5是一種可在沒有MMPs參與情況下水解聚集蛋白聚糖的酶[32-33]。研究證實，ADAMT5在OA動物模型[34]和人關節軟骨外植體[35]中均呈高表達。本研究檢測了人OA脛骨平臺標本軟骨/軟骨下骨中ADAMT5的表達，發現ADAMT5表達增加。最近有學者對OA關節軟骨細胞(ACC)和軟骨下骨成骨細胞體外共培養模型進行研究發現，ADAMTS和MMPs的上調與MAPK-ERK1/2信號的激活有關，而MAPK-ERK抑制劑PD98059可逆轉共培養細胞中ADAMTS和MMPs的過表達[23]，與本研究在人OA脛骨平臺標本軟骨下骨層面的檢測結果一致。

機體通過協調骨形成和骨吸收來實現骨重塑，其中成骨細胞沉積鈣化骨基質而破骨細胞再吸收骨[36-37]。活化的ERK1/2可調控軟骨下骨中成骨細胞和破骨細胞的分化而影響骨形成[38-39]，但OA關節中發生了異常骨重塑，軟骨下骨結構的變化導致應力不均勻及關節軟骨的退化，進一步導致未結合的骨重塑發生。本研究micro-CT及免疫組化染色結果顯示，與完整的軟骨組織相比，軟骨區損傷的軟骨下骨微結構發生異常增生，ERK1/2蛋白的磷酸化增加，誘導成骨細胞和破骨細胞的分化而導致異常骨重塑，進而誘發OA的發展。

綜上所述，本研究結果表明，OA軟骨/軟骨下骨中pERK1/2、MMP-3、MMP-9及ADAMT5呈高表達，且軟骨下骨微結構發生改變，而pERK1/2表達增加可能是蛋白降解酶活性增強及軟骨下骨微結構改變的原因之一。OA的病理機制復雜，其發生發展不僅與軟骨退變有關，還與軟骨下骨有關，但本研究缺乏對上述因子的對照實驗，須進一步在細胞培養和動物模型中利用抑制劑加以驗證，以期為OA的早期診斷及治療提供更多的理論依據。