中藥材33種禁用農殘檢測前處理方法的選擇

黃慧君 劉英發 程曉敏 李嵐 沈震亞

（江中藥業股份有限公司 江西南昌 330004）

中國是中草藥的發源地，使用中藥的歷史可追溯到幾千年前，但是隨著時代和環境的變遷，中藥的生存環境、種植模式及加工等其他方面都有很大的不同，中藥材作為中成藥的原料藥，它的質量與人類用藥安全和生命安全息息相關，所以中藥材質量檢測尤為重要，其中中藥材農藥殘留測定就是不可缺少的一項[1]。中國是中藥材用藥大國，但是在中藥材的品質管理方面依然有很多工作需要去落實，為了使中藥材種植業實現產業升級，國家發布了《中國藥典》（2020 版），明確規定了要對植物類藥材進行33種禁用農藥殘留量檢測，方法采用《中國藥典》（2020版）四部通則2341 下的第五法，其中規定了33種禁用農藥需要用到液相色譜- 質譜/ 質譜聯用法（LC-MS/MS） 和氣相色譜 - 質譜 / 質譜聯用法（GC-MS/MS）進行檢測，因此需要我們選擇合適的方法進行樣品前處理。但中藥材成分復雜多樣，基質效應各不相同[2]，為了保證所選前處理方法的可行性及檢驗結果的準確性，不同的中藥材需要適用不同的前處理方法進行檢測。本實驗旨在探究不同中藥材適用的前處理方法及根據中藥材性質選擇相應前處理方法的可行性。現報道如下：

1 儀器與材料

1.1 儀器 氣相色譜-串聯三重四極桿質譜儀（日本島津公司），高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀（AB SCIEX 公司），電子天平（SECURA 公司），旋轉蒸發儀（Lab Tech 公司），0.5～5 ml、0.1～1 ml、20～200 μl、2～20 μl 移 液 器 （RAININ 公 司），0.22 μm 濾 膜（NEWSTAR 公司），離心機（盧湘儀離心機儀器有限公司），振蕩器（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）。

1.2 試劑 質譜純乙腈（Merk 公司）、色譜純乙腈（廣東光華科技股份有限公司）、甲酸（山東西亞化學股份有限公司）、甲酸銨（Sigma-Aldrich 公司）、色譜純甲苯（西隴科學股份有限公司）、色譜純異丙醇（天津市大茂化學試劑廠）、水為超純水、34種混標（批號：S057535，來源：SHIMADZU 公司）、內標（批號：S058547，來源：SHIMADZU 公司）、30種混標（批號：S057527，來源：阿爾塔科技公司）。

1.3 樣品 陳皮（批號：2012802，來源：由江中藥業股份有限公司提供）、腫節風（批號：2103802，來源：由江中藥業股份有限公司提供）、炒萊菔子（批號：2103001，來源：由江中藥業股份有限公司提供）。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密量取禁用農藥混合對照品溶液（已標示各相關農藥品種的濃度）0.1 ml，置于10 ml 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 氣相色譜串聯質譜法分析用內標溶液的制備精密吸取磷酸三苯酯內標溶液0.1 ml（100 μg/ml），置于100 ml 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，即得0.1 μg/ml 的內標溶液。

2.1.3 空白基質溶液的制備 取空白基質樣品，同供試品溶液的制備方法處理制成空白基質溶液。

2.1.4 標準曲線的配制 分別精密量取空白基質溶液1.0 ml（6 份），置于氮吹儀上，40℃水浴濃縮至約0.6 ml，分別加入混合對照品溶液 10 μl、20 μl、50 μl、100 μl、150 μl、200 μl，加乙腈稀釋至 1 ml，渦旋混勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備 按照《中國藥典》（2020版）四部通則2341 農藥殘留測定法第五法《藥材及飲片（植物類）中禁用農藥多殘留測定法》[3]中的直接提取法及固相萃取法進行提取凈化。根據陳皮、腫節風、炒萊菔子三者化學成分的不同，結合固相萃取第一、二、三法固相萃取柱組成成分特點，選擇使用不同提取凈化方法。陳皮主要含有黃酮類、生物堿類、檸檬苦素類、揮發油類，選擇直接提取法+固相萃取第一法，或直接提取法+固相萃取第二法提取凈化。腫節風主要成分較為復雜，含有含揮發油、酯類、酚類、鞣質、黃酮、氰甙、香豆素等且顏色較深[4]，選擇直接提取法+固相萃取第一法，或直接提取法+固相萃取第三法提取凈化。炒萊菔子主要含有脂肪油、揮發油，選擇直接提取法+固相萃取第一法，或直接提取法+固相萃取第二法提取凈化。

2.3 測定法

2.3.1 氣相色譜-串聯質譜法 分別精密吸取上述的基質混合對照溶液和供試品溶液各1 ml，精密加入內標溶液0.3 ml，混勻，濾過，取續濾液。分別精密吸取上述兩種溶液各1 μl，注入氣相色譜串聯質譜儀，按內標標準曲線法計算，即得。

2.3.2 高效液相色譜-串聯質譜法 分別精密吸取上述的基質混合對照溶液和供試品溶液各1 ml，精密加入水0.3 ml，混勻，濾過，取續濾液。分別精密吸取上述兩種溶液各2 μl，注入液相色譜-串聯質譜儀，按外標標準曲線法計算，即得。

3 試驗結果

3.1 陳皮檢驗結果 氣質聯用儀及液質聯用儀檢測結果顯示，采用固相萃取第一法凈化后上機，線性相關系數均在0.990 3～0.999 8 之間，重復性6 針之間的RSD 均在10%以下，定量限加標回收率均在73.23%～111.52%之間。但是采用固相萃取第二法時，氣質聯用儀檢測結果顯示：甲基對硫磷回收率為43.58%、氟蟲腈回收率為49.34%、水胺硫磷回收率為 54.52%、2,4′- 滴滴涕回收率為 175.40%、4,4′- 滴滴涕回收率為187.97%、蠅毒磷回收率為55.05%。液質聯用儀檢測結果顯示：采用固相萃取第二法凈化后上機甲胺磷性相關系數為0.913 5、甲拌磷相關系數為0.911 2、內吸磷相關系數為0.958 2、水胺硫磷相關系數為0.944 2，線性相關系數均＜0.99，而甲胺磷、水胺硫磷、甲拌磷、內吸磷加標回收率分別為66.36%、55.21%、46.81%，均不在70%～120%之間。綜合以上結果，陳皮采用直接提取法結合固相萃取第一法提取較好。見表1。

表1 陳皮檢驗結果

3.2 腫節風檢驗結果 氣質聯用儀及液質聯用儀的檢測結果顯示，采用固相萃取第三法凈化后上機，線性相關系數均在0.994 1～0.999 9 之間，重復性6針之間的RSD 均在10%以下，定量限加標回收率均在70.08%～111.30%之間。但是采用固相萃取第一法時，氣質聯用儀檢測結果顯示：2,4′-滴滴涕線性相關系數為0.963 5、4,4′-滴滴涕線性相關系數為0.865 9。液質聯用儀檢測結果顯示，采用固相萃取第一法凈化后上機甲胺磷性相關系數為0.913 5、甲拌磷相關系數為0.905 2、地蟲硫磷相關系數為0.851 2、水胺硫磷相關系數為0.953 2，線性相關系數均＜0.99，而甲胺磷、水胺硫磷、甲基異柳磷、內吸磷加標回收率分別為56.36%、63.21%、48.21%，均不在70%～120%之間。綜合以上結果，腫節風采用直接提取法結合固相萃取第三法提取較好。見表2。

表2 腫節風檢驗結果

3.3 炒萊菔子檢驗結果 氣質聯用儀及液質聯用儀的檢測結果顯示，當液質聯用儀采用固相萃取第一法、氣質聯用儀采用固相萃取第二法凈化后上機，線性相關系數均在0.991 1～0.999 9 之間，重復性6針之間的RSD 均在10%以下，定量限加標回收率均滿足64.03%～115.32%。液質聯用儀檢測結果顯示，采用固相萃取第二法凈化后上機地蟲硫磷相關系數為0.926 8、甲拌磷相關系數為0.933 2、內吸磷相關系數為0.906 8、甲基異柳磷相關系數為0.9620，線性相關系數均＜0.99，而治螟磷、內吸磷、甲基異柳磷、加標回收率分別為56.36%、43.21%、68.21%，均不在70%～120%之間。綜合以上結果，炒萊菔子氣質聯用儀及液質聯用儀分別采用直接提取法結合固相萃取第二法和直接提取法結合固相萃取第一法提取。見表3。

表3 炒萊菔子檢驗結果

3 討論

在提取方式的選擇上，本實驗采取振蕩提取方式，即在中藥材粉末中加入規定量乙腈，調節振蕩頻率至2 500，振蕩15 min，使乙腈與中藥材粉末充分接觸提取。相比于超聲提取和勻漿提取具有方便，高效，簡單的特點[5]。《中國藥典》（2020 版）未對旋蒸溫度明確規定，以乙腈沸點為指導，限制旋蒸溫度不超過40℃。本實驗選用30℃對提取溶液進行旋蒸，在此溫度下，中藥材農殘不易被破壞，加樣回收率良好。實驗過程中發現藥材只經過直接提取法而不凈化，中藥材中的色素、揮發油、黃酮類等復雜的化學成分無法去除，會極大地干擾實驗，也會對整個檢驗系統產生影響[6]。固相萃取第一法及固相萃取第三法均能去除直接提取法提取后的藥材溶液顏色，但固相萃取第一法對于以腫節風為代表的全草類藥材，色素去除能力不如固相萃取第三法，氣質聯用儀結果顯示固相萃取第一法對殺蟲脒具有強抑制作用，回收率均在60%以下。固相萃取第二法及固相萃取第一法均能去除油脂類揮發油類化合物。但油脂含量高的化合物采用氣質聯用儀檢測，用固相萃取第二法效果顯著，基質干擾小。而對于液質聯用儀，用固相萃取第一法效果更明顯。

實驗確定了陳皮、腫節風、炒萊菔子三種具有代表性的中藥材的前處理提取凈化方式。通過評價不同提取凈化方式下的線性相關系數、定量限加標回收率，確定了陳皮使用直接提取法+固相萃取第一法提取凈化，腫節風使用直接提取法+固相萃取第三法提取凈化，炒萊菔子使用（液質）直接提取法+固相萃取第一法，（氣質）直接提取法+固相萃取第二法，為不同中藥材前處理提取凈化方式的選擇提供了依據。