豬腎上皮細(xì)胞SLA-1基因的克隆及分子結(jié)構(gòu)特征分析

王寶寶，金 行，鮮鈺涵，馮宏盛，高鳳山

(大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622)

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)是位于細(xì)胞表面能夠識(shí)別抗原并調(diào)節(jié)免疫功能的糖蛋白[1]。豬的MHC又稱為豬白細(xì)胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)。SLA分為三類，分別是SLAⅠ、SLAⅡ和SLA Ⅲ[2]。其中，SLAⅠ類基因主要負(fù)責(zé)遞呈內(nèi)源性抗原肽，并引起細(xì)胞免疫[3]。SLAⅠ類分子包括輕鏈和重鏈，輕鏈由單一態(tài)性的β2微球蛋白(β2 microglobulin,β2m)組成[4]，重鏈包含SLA-1、SLA-2和SLA-3三類具有多態(tài)性的功能基因座，其中SLA-1與SLA-3均比SLA-2在信號(hào)肽的起始部位少3個(gè)氨基酸，即21個(gè)氨基酸[5]。然而，SLA-1在3個(gè)功能基因中多態(tài)性最強(qiáng)[6]。SLA-1基因是SLAⅠ類分子重鏈分子，包括細(xì)胞質(zhì)區(qū)、穿膜區(qū)和胞外區(qū)。其中，胞外區(qū)包括α1、α2和α3亞區(qū)，每個(gè)亞區(qū)大約含有90個(gè)氨基酸。α1和α2構(gòu)成抗原多肽結(jié)合槽(peptide-binding groove)，結(jié)合8～10個(gè)氨基酸的多肽[7]，這些多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被SLA-1重鏈結(jié)合，然后經(jīng)高爾基體加工修飾，形成正確的折疊，最后遞呈到細(xì)胞表面被CD8+T淋巴細(xì)胞識(shí)別，引起細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答[8-9]。根據(jù)SLA-1體內(nèi)遞呈抗原多肽的原理，許多學(xué)者開始在體外表達(dá)SLA-1，研究其體外結(jié)合抗原多肽的機(jī)理，并篩選抗原多肽，以進(jìn)行病毒表位多肽疫苗的研制[10-11]。然而，由于SLA-1基因存在多態(tài)性，在SLA-1基因的選擇和抗原表位的篩選方面還沒有建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。在此情況下，選擇一種具有代表性的SLA-1基因及其生物材料，既能方便獲得又易于進(jìn)行后續(xù)基因功能研究顯得尤為必要。

本試驗(yàn)所用豬腎上皮細(xì)胞15(PK15)，其父母代源自1955年美國(guó)Stice提供的成年豬腎細(xì)胞PK-2a，后被ATCC收藏(CCL-33)[12]。該細(xì)胞能夠穩(wěn)定傳代， 培養(yǎng)技術(shù)成熟， 細(xì)胞株容易獲得， 是目前應(yīng)用最廣泛的豬源傳代細(xì)胞系之一， 可以作為細(xì)胞免疫研究的工具， 在多個(gè)研究領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用[13-14]。國(guó)外學(xué)者從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平分別證明了PK15細(xì)胞能夠表達(dá)SLAⅠ類分子[15-16]，SLA-1為SLAⅠ類分子功能基因之一，推測(cè)該基因在PK15細(xì)胞表達(dá)。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)PK15細(xì)胞SLA-1在基因水平系統(tǒng)的研究鮮見報(bào)道，尤其是對(duì)于該基因詳細(xì)的序列信息、分子進(jìn)化特點(diǎn)、氨基酸變異及分子結(jié)構(gòu)特征還缺乏系統(tǒng)研究。本課題組前期研究已經(jīng)建立了PK15細(xì)胞穩(wěn)定傳代和培養(yǎng)條件，并已經(jīng)證明輕鏈β2m在PK15細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)[17]。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)通過克隆PK15細(xì)胞的SLA-1基因序列，分析其基因特征和分子進(jìn)化關(guān)系，解析其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為下一步建立系統(tǒng)的PK15細(xì)胞SLA-1抗原表位篩選及開展其他相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

PK15細(xì)胞株購自中國(guó)微生物菌種保藏管理中心(產(chǎn)品編號(hào)：ATCC?CCL-33TM)；Solution Ⅰ、dNTP、AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 DNA Marker、ExTaq酶、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ均購自寶生物工程(大連)有限公司；Trizol購自Invitrogen公司；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞由大連大學(xué)分子免疫實(shí)驗(yàn)室保存；無水乙醇、氯仿、異丙醇、DEPC、低分子量蛋白Marker、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、氨芐青霉素均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

參考GenBank中SLA-1基因序列(登錄號(hào)：AY459306)，使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)其特異性引物，SLA-1-PK15-F:5′-CATGGGGCCT-GGAGCCCTCT-3′；SLA-1-PK15-R:5′-CTCAAC-TCCTCATGGCACCAATTAG-3′，產(chǎn)物大小為1 419 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 SLA-1基因的克隆及測(cè)序

1.3.1 PK-15細(xì)胞總RNA提取及cDNA合成 復(fù)蘇凍存的PK15細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，傳代1次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，然后按照Gao等[18]的方法利用Trizol試劑盒提取總RNA。 最后將沉淀加入 20 μL 0.1% DEPC水溶解，在 60 ℃下孵育 5 min，-80 ℃保存。取 2 μL PK15細(xì)胞總RNA，分別加入2 μL的Oligo(dT)(15T)(100 mol/L)、2 μL AMV buffer、4 μL dNTP(2.5 mol/L)、1 μL AMV(10 U)，最后用0.1% DEPC水補(bǔ)至20 μL，42 ℃作用1 h進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2SLA-1基因的克隆及測(cè)序 以1.3.1合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL：ExTaq酶0.25 μL，10×Buffer 5 μL，MgCl2Solution 2 μL，dNTP Mix 1 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用膠回收試劑盒回收目的基因PCR產(chǎn)物，然后參照高鳳山等[19]的方法將目的基因連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)16 h后挑單克隆，按照堿裂解法提取質(zhì)粒，利用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切鑒定，陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

用Genetyx 9.0進(jìn)行序列分析，序列登錄入GenBank BankIt (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)。序列多重比較及分子進(jìn)化樹用DNAMAN 5.2.2 (Lynnon BioSoft Co.，LTD)和Mega 5.0 軟件(Mega Software Co.，Ltd)的Neighbor-Joining 法分析繪制。將PK15細(xì)胞SLA-1蛋白胞外區(qū)氨基酸序列與GenBank和IPD Database代表性的SLA-1序列胞外區(qū)通過Multalin (http:∥multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)[20]進(jìn)行多重序列比較，并分析二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)中已解析的動(dòng)物MHCⅠ蛋白的三維結(jié)晶結(jié)構(gòu)(3D)為模板，利用http:∥www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.htl同源模建SLA-1蛋白的三維結(jié)構(gòu)，Rasmol分析其結(jié)構(gòu)特征，推測(cè)其功能[18]。

2 結(jié) 果

2.1 SLA-1基因的擴(kuò)增與克隆

從PK15細(xì)胞提取總RNA后，RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1A所示，擴(kuò)增條帶約在1 400 bp位置，與理論值1 419 bp相符。重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果顯示，插入基因大小約1 400 bp，與PCR擴(kuò)增大小一致(圖1B)。

2.2 SLA-1基因序列測(cè)定及分析

陽性克隆經(jīng)生物公司測(cè)序，序列經(jīng)Genetyx 9.0分析，證實(shí)PK15細(xì)胞SLA-1基因大小為1 419 bp，其中2-1 087 bp為編碼區(qū)，共編碼361個(gè)氨基酸，信號(hào)肽為21個(gè)氨基酸(圖2)，符合SLA-1基因特征。 序列提交到GenBank BankIt，獲得登錄號(hào)：OK321186。

2.3 SLA-1*PK15系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SLA-1*PK15與SLA-1*wxd(中國(guó)梅山豬)和SLA-1*0401(中國(guó)巴馬小型豬)進(jìn)化關(guān)系最近，而與SLA-1*lr02(丹麥長(zhǎng)白豬)及SLA-1*0509(中國(guó)西藏野豬)進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，SLA-1基因RT-PCR產(chǎn)物樣品；3，重組質(zhì)粒；4，重組質(zhì)粒雙酶切鑒定M,DL2000 DNA Marker;1 and 2,RT-PCR products of SLA-1 gene;3,Recombinant plasmid;4,Identification of recombinant plasmid by double digestion圖1 RT-PCR擴(kuò)增SLA-1基因(A)和重組質(zhì)粒雙酶切檢測(cè)(B)Fig.1 Detection of SLA-1 gene amplified by RT-PCR (A) and recombinant plasmids by double digestion (B)

第一個(gè)堿基A(加陰影部分)為非編碼基因，為了便于編碼區(qū)翻譯，核苷酸計(jì)數(shù)從第2個(gè)核苷酸開始The first base A is a non-coded gene.In order to translate the coding region more easily,the numbering nucleotide was changed to the second nucleotide圖2 PK15細(xì)胞SLA-1基因氨基酸序列分析Fig.2 Amino acid sequence analysis of SLA-1 gene in PK15 cells

圖3 SLA-1基因編碼氨基酸進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of amino acids encoded by SLA-1 gene

2.4 PK15細(xì)胞SLA-1蛋白胞外區(qū)氨基酸比較及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

為了分析PK15細(xì)胞SLA-1蛋白胞外區(qū)氨基酸特征，將SLA-1與分子進(jìn)化樹中具有代表性的SLA-1進(jìn)行胞外區(qū)氨基酸比對(duì)，同時(shí)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PK15細(xì)胞SLA-1與其他SLA-1蛋白胞外區(qū)主要變異位點(diǎn)均存在于α1區(qū)和α2區(qū)，α3區(qū)的變異位點(diǎn)較少。其中，α1區(qū)的變異位點(diǎn)最集中，3個(gè)連續(xù)變異氨基酸位置有6個(gè)，包括R17-R21、P42-M44、Q53-E58、D61-E63、R65-A71和T73-V76；α2區(qū)3個(gè)連續(xù)變異氨基酸區(qū)域只有2個(gè)，包括C100-L102和W147-E152。與其他SLA-1蛋白相比較，SLA-1 PK15細(xì)胞蛋白不存在特征性的氨基酸變異位點(diǎn)。 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，PK15細(xì)胞SLA-1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和β-折疊為主，α1區(qū)具有1個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊，α2區(qū)具有4個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊。α3區(qū)主要以β-折疊為主，存在9個(gè)β-折疊(圖4)。

2.5 PK15細(xì)胞SLA-1蛋白同源建模及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

以已解析的動(dòng)物MHCⅠ三級(jí)結(jié)構(gòu)為模板，將PK15細(xì)胞SLA-1進(jìn)行同源建模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PK15細(xì)胞SLA-1蛋白具有SLA class Ⅰ典型的三級(jí)結(jié)構(gòu)，α1區(qū)和α2區(qū)構(gòu)成抗原多肽結(jié)合區(qū)，包括側(cè)面的α-螺旋，底部由8個(gè)反向平行的β-折疊構(gòu)成。α3區(qū)主要由β-折疊和部分無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖5)。

圖4 SLA-1蛋白胞外區(qū)氨基酸多重比較及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Multiple comparison of amino acids of extracellular domain and analysis of secondary structure of SLA-1 protein

圖5 SLA-1蛋白同源建模三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure of SLA-1 protein by homology modeling

3 討 論

豬SLA-1主要功能為抗原遞呈，識(shí)別抗原并誘導(dǎo)細(xì)胞免疫,而起抗原遞呈功能的主要部位為SLA-1的胞外區(qū)[21]。近年來，SLA-1基因在抗原多態(tài)性、基因表達(dá)、分子進(jìn)化以及抗原遞呈等方面的研究取得了較大的進(jìn)展[11,18,22]。然而，由于SLA-1基因多態(tài)性的存在，對(duì)SLA-1基因功能方面的研究尤其是在抗原遞呈和表位篩選方面存在標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、缺乏有效參照的問題。PK15細(xì)胞是一個(gè)穩(wěn)定的傳代細(xì)胞系，具有建立標(biāo)準(zhǔn)的SLA-1基因功能研究細(xì)胞模型的潛在應(yīng)用價(jià)值。因此，對(duì)于探究SLA-1基因是否在PK15細(xì)胞穩(wěn)定存在，并對(duì)該基因進(jìn)行克隆、序列分析等涉及其生物信息學(xué)研究具有十分重要的意義。

本試驗(yàn)通過查閱文獻(xiàn)及在前期研究[23]的基礎(chǔ)上，從PK15細(xì)胞中成功克隆得到SLA-1基因，經(jīng)序列分析證實(shí)該基因信號(hào)肽含有21個(gè)氨基酸，符合SLA-1基因特征，與Chardon等[5]報(bào)道一致，說明SLA-1基因在PK15細(xì)胞中穩(wěn)定存在。進(jìn)一步的序列比對(duì)和分子進(jìn)化樹分析證實(shí)SLA-1*PK15與SLA-1*wxd(中國(guó)梅山豬)和SLA-1*0401(中國(guó)巴馬小型豬)進(jìn)化關(guān)系最近，而與SLA-1*lr02(丹麥長(zhǎng)白豬)及SLA-1*0509(中國(guó)西藏野豬)進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，揭示今后以PK15細(xì)胞進(jìn)行SLA-1抗原表位篩選后，表位肽功能試驗(yàn)可選擇的動(dòng)物具有了參考標(biāo)準(zhǔn)。PK15細(xì)胞SLA-1蛋白胞外區(qū)及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，SLA-1無特征性變異氨基酸，揭示PK15細(xì)胞SLA-1蛋白可以作為一個(gè)普適性的功能基因研究抗原遞呈或表位篩選，有利于獲得普適性的抗原表位，用于表位疫苗研制[24]。另外，胞外區(qū)的多重比較結(jié)果表明，SLA-1的α1區(qū)有6個(gè)主要的氨基酸變異區(qū)，α2區(qū)有2個(gè)主要的抗原變異位點(diǎn)區(qū)，為今后進(jìn)行抗原表位的設(shè)計(jì)和表位篩選提供了數(shù)據(jù)。同源模建分析PK15細(xì)胞SLA-1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，PK15細(xì)胞SLA-1蛋白呈現(xiàn)典型的SLA classⅠ的結(jié)構(gòu)特征，具有完整的抗原多肽結(jié)合槽，與Pan等[25]報(bào)道的豬SLA-1晶體結(jié)構(gòu)相似，因此可推測(cè)該基因具有良好的抗原多肽結(jié)合功能。

4 結(jié) 論

本研究從PK15細(xì)胞中成功克隆了SLA-1基因，獲得了該基因序列并提交GenBank獲得登錄號(hào):OK321186，闡明了該基因的分子進(jìn)化關(guān)系，并證實(shí)該基因具有普適性的分子結(jié)構(gòu)特征及良好的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)特征，為今后系統(tǒng)開展PK15細(xì)胞系SLA-1基因結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ)。