病原感染后雞miRNAs調(diào)控的研究進展

張育銘，陳喬光，候照峰，劉丹丹，陶建平，許金俊

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州 225009；2.江蘇動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009)

microRNAs(miRNAs)是由動物、植物、病毒和部分單細胞生物表達的一種短的非蛋白編碼RNA，大小約為22個核苷酸[1]。Lee等[2]在1993年從秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中首次發(fā)現(xiàn)可調(diào)控胚胎后期發(fā)育的小分子RNAlin-4，miRNAs對細胞信號網(wǎng)絡(luò)具有不可忽視的調(diào)控作用。在真核生物中有2/3的編碼基因受miRNAs的調(diào)控[3]，參與許多生理過程的調(diào)控，如發(fā)育、細胞分裂、增殖和調(diào)亡、脂類代謝、激素分泌等，并且在炎癥反應(yīng)、免疫相關(guān)途徑、腫瘤發(fā)生相關(guān)途徑、蛋白質(zhì)修飾相關(guān)途徑等過程中發(fā)揮著重要作用。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，miRNAs的研究也越來越深入，近年來研究發(fā)現(xiàn)，病原如病毒[4]、細菌[5]、寄生蟲[6]感染雞后均會引起miRNAs的變化。文章就近年來部分病毒、細菌、寄生蟲感染后，雞miRNAs的變化和調(diào)控機制的研究進行綜述，以期為從miRNAs的角度對雞病的診斷、治療和防控提供一定的參考。

1 miRNAs的生物合成及其功能

在動物中，miRNAs的生物合成起始于細胞核內(nèi)RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ對DNA的轉(zhuǎn)錄[7]，生成初級miRNA(primary-miRNA，pri-miRNA)。之后pri-miRNA在細胞核內(nèi)被核酸內(nèi)切酶RNase Ⅲ(drosha ribonuclease Ⅲ，Drosha)切割成具有特征性發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNA(precursor-miRNA，pre-miRNA)[8-9]。隨后，轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5識別pre-miRNA的3′-端，將其運送到細胞質(zhì)中。在細胞質(zhì)中，雙鏈RNA專一性內(nèi)切酶(Dicer酶)識別pre-miRNA雙鏈的3′和5′-末端信號，將其剪切成22個核苷酸左右的成熟miRNA雙鏈。隨后，雙鏈分離成2條單獨的鏈，其中1條miRNA鏈通常被降解，另一條miRNA鏈與AGO蛋白、雙鏈RNA結(jié)合蛋白、Dicer酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)基因沉默復(fù)合物(RISC)后發(fā)揮功能[10]。miRNA 5′-區(qū)域存在一段2～8個核苷酸的種子序列，該段序列通常特異性的與其靶基因3′-非翻譯區(qū)(UTR)部分或完全結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制或降解mRNA介導(dǎo)的基因沉默[11]，調(diào)控生理機能如發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化等，參與免疫反應(yīng)、代謝、生物合成，并可以作為疾病預(yù)后和診斷的生物標(biāo)志物。此外，miRNAs的表達在真核生物不同發(fā)育階段有其特定的表達模式，具有嚴(yán)格的組織和時間特異性。

2 病毒感染雞體后miRNAs的調(diào)控

2.1 傳染性法氏囊病病毒感染

雛雞是傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)的自然宿主之一，感染后會導(dǎo)致發(fā)病雞法氏囊先腫大后萎縮，引起免疫功能障礙，造成嚴(yán)重的免疫抑制。IBDV感染后，會激活雞體內(nèi)的部分miRNAs，這些miRNAs可以靶向IBDV的衣殼蛋白(VP)或基因組的特定序列，抑制IBDV的復(fù)制[4，12]。 Wang等[4]篩選了5種抗VP2的miRNAs用于構(gòu)建表達載體，并將其轉(zhuǎn)染進雞胚成纖維細胞(DF-1)中，可顯著抑制VP2的表達。 隨后選擇了更有效的miR-VP2A和miR-VP2E轉(zhuǎn)染進DF-1細胞中，之后感染IBDV，結(jié)果顯示單獨和共表達的miR-VP2A和miR-VP2E引起病毒滴度顯著降低，抑制作用至少持續(xù)120 h。這表明靶向VP2的miRNAs可以有效抑制IBDV病毒的復(fù)制。Wang等[12]利用基因芯片技術(shù)從IBDV感染的DF-1和法氏囊中篩選出gga-miR-21，構(gòu)建慢病毒載體使其在感染IBDV的DF-1中過表達，發(fā)現(xiàn)IBDV VP1的表達水平下降，IBDV的復(fù)制受到抑制。

樹突狀細胞(DC)作為一種抗原遞呈細胞，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。干擾素(IFN)是機體受到病原刺激后，產(chǎn)生的一種具有抗病毒、抗腫瘤、抑制細胞增殖、調(diào)節(jié)免疫作用的糖蛋白。IFN的表達與宿主細胞中細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)的表達密切相關(guān)。Fu等[13]在感染IBDV的DF-1細胞中發(fā)現(xiàn)了一系列顯著差異表達的miRNAs，其中g(shù)ga-miR-130b可以通過靶向IBDV基因組片段A的特定序列抑制IBDV復(fù)制，并通過靶向宿主細胞中SOCS5增強IFN-β的表達。同時，F(xiàn)u等[14]還發(fā)現(xiàn)，gga-miR-454可以靶向IBDV基因組片段B的特定序列抑制IBDV復(fù)制，并且gga-miR-454通過靶向SOCS6增加了IFN-β的表達。之后Duan等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)了一種誘導(dǎo)性的抗IBDV感染的介質(zhì)——gga-miR-27b-3p，它可以靶向SOCS3和SOCS6，從而增強Ⅰ型干擾素表達，提高信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)在701位酪氨酸的磷酸化水平，抑制IBDV的復(fù)制。

miRNAs的變化不只是有利于宿主的，也可能是有利于病毒的。IBDV感染DF-1后，會引起雞p53(Chp53)表達上調(diào)，從而抑制IBDV的復(fù)制。Ouyang等[16]的研究表明，gga-miR-2127能夠靶向Chp53 mRNA的3′-UTR，抑制Chp53的表達，從而促進IBDV的復(fù)制。 此外，Ouyang等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，干擾素調(diào)節(jié)因子2(IRF2)的3′-UTR與gga-miR-9*有2個結(jié)合位點，gga-miR-9*通過靶向IRF2抑制抗病毒先天免疫中IFN的產(chǎn)生，負調(diào)節(jié)宿主的抗病毒天然免疫反應(yīng)，促進IBDV復(fù)制。

2.2 J亞型禽白血病病毒感染

禽白血病是一種能夠在雞群中垂直傳播的腫瘤性疾病，一直以來J亞型禽白血病病毒(Avian leukosis virus-J,ALV-J)被認為可以通過精子進行垂直傳播，精子miRNAs的變化與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Chen等[18]對ALV-J感染雞的精子細胞外小泡進行深度測序，發(fā)現(xiàn)了9種差異表達的miRNAs，6個上調(diào)，3個下調(diào)，其中下調(diào)的miR-138-5p被認為是一種腫瘤抑制因子，在多種癌癥中表達下調(diào)，包括乳腺癌[19]和肺癌[20]。該研究的結(jié)果表明，ALV-J感染后會引起雞精子miRNAs發(fā)生變化，且部分變化的miRNAs被證明與腫瘤性疾病相關(guān)。

禽白血病的特征性病變是引起肝臟等器官出現(xiàn)淋巴瘤，導(dǎo)致肝臟破裂出血，引起感染雞死亡。許多報告表明，差異表達的miRNAs可以促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展[21-23]。Li等[24]利用miRNAs微陣列技術(shù)在未感染和感染ALV-J的10周齡雛雞肝臟中檢測出12個差異表達的miRNAs，其中g(shù)ga-miR-221、gga-miR-222、gga-miR-1456、gga-miR-1704、gga-miR-1777、gga-miR-1790和gga-miR-2127表達上調(diào)，gga-let-7b、gga-let-7i、gga-miR-125b、gga-miR-375和gga-miR-458表達下調(diào)。Wang等[25]利用miRNAs微陣列研究了ALV-J感染238 d后雞肝臟腫瘤中miRNAs表達的變化，與對照組相比，4個miRNAs表達差異，gga-miR-221表達顯著上調(diào)，gga-miR-193a、gga-miR193b和gga-miR-125b表達顯著下調(diào)。差異表達的miRNAs與Li等[24]的研究結(jié)果略有不同，可能是雞品種和日齡差異的原因?qū)е?。在Lambeth等[26]的研究中，差異表達的miRNAs中上調(diào)的miR-221和miR-222可抑制腫瘤抑制因子和細胞周期抑制因子p27Kip1的表達；在Garofalo等[27]的報道中，miR-221和miR-222的下調(diào)導(dǎo)致癌細胞凋亡。Ji等[28]的研究首次報道了ALV-J感染過程中DF-1細胞miRNAs表達水平的變化，選取了7個已報道的miRNAs(let-7b/7i、miR-221/222、miR-125b、miR-375b和miR-2127)，其中6個miRNAs與腫瘤發(fā)生相關(guān)。研究結(jié)果表明，在感染引起骨髓瘤的ALV-J株(NX0101)和引起血管瘤的ALV-J株(GD1109)的細胞中，除gga-miR-375外，其余6個miRNAs均在感染后1 h表達上調(diào)。在感染后第2天，7個miRNAs在感染的DF-1細胞中均表達上調(diào)。感染后第6天，2株不同表型的ALV-J株感染DF-1細胞后，gga-let-7b、gga-miR-125b和gga-miR-375表達下調(diào)，gga-miR-221和gga-miR-222表達上調(diào)。而感染NX0101的DF-1細胞中g(shù)ga-let-7i的表達降低，感染GD1109的細胞中g(shù)ga-let-7i的表達增強，而gga-miR-2127在感染和未感染細胞中的表達無顯著差異。該研究加深了對腫瘤相關(guān)機制和ALV-J與宿主相互作用的理解，證明了在ALV-J感染過程中，miRNAs可動態(tài)調(diào)節(jié)靶基因的表達。

巨噬細胞在宿主防御入侵病原體中起著至關(guān)重要的作用。Dai等[29]采用全轉(zhuǎn)錄組分析的方法，對雞原代單核細胞來源的巨噬細胞(MDM)中的宿主因子包括基因、miRNAs、長鏈非編碼RNA(lncRNA)及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行了分析。在ALV-J感染后3 h(3hpi)，在MDM中共檢測到128個差異表達的lncRNAs和15個差異表達的miRNAs，在感染后36 h的MDM中分別檢測到30個差異表達的lncRNAs和8個差異表達的miRNAs。該研究進一步構(gòu)建了差異表達的lncRNAs-mRNAs、miRNA-mRNAs和lncRNAs-miRNA-mRNAs相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果提示，在ALV-J感染后3 h的MDM中，差異表達的lncRNAs和miRNAs通過互作網(wǎng)絡(luò)參與了非受體酪氨酸激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，Jak-STAT)信號通路中細胞周期蛋白D3(CCND3)和SOCS5的調(diào)控。該研究結(jié)果全面揭示了雞原代巨噬細胞中非編碼RNA與ALV-J的關(guān)系。

環(huán)狀RNA(circRNAs)在進化上是保守的，并且廣泛存在，circRNAs比線性RNA更穩(wěn)定，因此可能參與不同的生物學(xué)過程[30]。而且有越來越多的證據(jù)表明，circRNAs可以與癌癥相關(guān)的miRNAs聯(lián)系起來，通過circRNA/miRNA/mRNA軸作為癌癥相關(guān)途徑的調(diào)節(jié)因子[31-32]。miR-375是一種成熟的腫瘤抑制因子miRNA，在許多類型的癌癥中異常表達，是潛在的抑制癌癥和藥物治療的靶點[33]。miR-375的差異表達已被證明與腫瘤侵襲性和發(fā)展過程相關(guān)[34-35]。在Li等[36]的報道中，證明了下調(diào)的gga-miR-375可以作為一種腫瘤抑制因子，靶向Yes相關(guān)蛋白(YAP)基因，抑制細胞增殖，促使癌細胞凋亡。Zhang等[37]的研究證明了YAP1是gga-miR-375的靶基因，支持了Li等[36]的研究結(jié)果。隨后在此基礎(chǔ)上通過RNA免疫沉淀(RIP)、生物素化RNA下拉實驗和RNA熒光原位雜交(RNA-FISH)實驗，證實CIRC-Vav3是gga-miR-375的上游靶基因，證明了ALV-J可以通過CIRC-Vav3/gga-miR-375/YAP1軸影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志物從而促進腫瘤發(fā)生。

ALV-J感染雞后miRNAs的變化，可能有利于宿主，也可能有利于病毒。Yu等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在ALV-J感染雞胚成纖維細胞(CEF)過程中，gga-miR-148a-5p的表達明顯下調(diào)。雙熒光素酶報告基因分析表明，3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDPK1)是gga-miR-148a-5p的直接靶基因，在體外，gga-miR-148a-5p過表達顯著促進ALV-J感染的CEF細胞增殖，包括細胞周期，而抑制gga-miR-148a-5p則相反。抑制PDPK1可促進ALV-J感染細胞增殖和細胞周期，說明gga-miR-148a-5p靶向PDPK1可抑制ALV-J感染細胞的增殖和細胞周期。此外，Li等[39]在ALV-J感染雞的脾臟與未感染脾臟167個差異表達的miRNAs中，驗證了上調(diào)的miR-34b-5p可以直接靶向黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)，抑制MDA5可加速了ALV-J感染細胞的增殖、細胞周期和遷移，促進ALV-J的復(fù)制。此外，在Li等[40]先前的報道中，上調(diào)的miR-23b可以直接靶向干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)，顯著降低IRF1 mRNA表達水平，從而降低IFN-β，負調(diào)節(jié)宿主的抗病毒天然免疫反應(yīng)，從而促進ALV-J的復(fù)制。

2.3 禽流感病毒感染

禽流感是一種傳染性強，傳播速度快的人獸共患傳染病，禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)變異速度快、基因型眾多，給全球養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。Wang等[41]通過高通量測序技術(shù)在H5N3感染雞的肺臟和氣管中分別鑒定出73和36個差異表達的miRNAs，其中在感染和未感染肺臟的比較中，下調(diào)的miRNAs的靶基因顯著富集在對病毒的應(yīng)答、免疫系統(tǒng)反應(yīng)、淋巴細胞和肺臟發(fā)育的過程，在感染和未感染氣管的比較中，下調(diào)的miRNAs靶標(biāo)中，白細胞介素12(IL-12)的產(chǎn)生和生物合成過程富集倍數(shù)最高；肺臟、氣管感染組與非感染組比較表達上調(diào)miRNAs的靶點，在免疫相關(guān)的GO富集項中顯著富集；在H5N3感染雞后，肺臟和氣管中下調(diào)的miRNAs調(diào)控幾乎不同的過程，而上調(diào)的miRNAs調(diào)控幾乎相同的過程，以應(yīng)對病毒的感染；該結(jié)果表明，miRNAs即便存在組織特異性，但在病原感染后，相關(guān)聯(lián)的組織如肺臟和氣管中部分miRNAs依然能夠發(fā)揮相同或相似的功能以應(yīng)對病原感染。隨后，Wang等[42]通過對H5N3感染雞肺臟組織miRNAs表達與mRNA轉(zhuǎn)錄組的綜合分析，發(fā)現(xiàn)了121個差異表達的miRNAs和508個差異表達的mRNAs；通過結(jié)合平行mRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)某些mRNA在差異表達的miRNAs的調(diào)控下并沒有發(fā)生差異表達，如在免疫相關(guān)基因IL-17受體D中預(yù)測了7個差異表達的miRNAs的結(jié)合位點，其中5個miRNAs在H5N3感染后上調(diào)，2個miRNAs下調(diào)，導(dǎo)致IL-17受體D在這些差異表達miRNAs不同的調(diào)控方向下沒有發(fā)生差異表達。此外，病毒侵入后，細胞miRNAs也可以靶向病毒基因，如gga-miR-34a不僅有14個免疫相關(guān)靶基因，而且還針對AIVHA、NA、PA、聚合酶堿性蛋白1(PB1)和PB2基因，gga-miR-32可以靶向HA和NS基因，gga-miR-30b靶向M和NA基因。O’Dowd等[43]通過分析低致病性AIV H4N6感染雞氣管環(huán)后氣管細胞釋放的胞內(nèi)和胞外小泡(EV)的miRNAs表達譜，在所有的細胞和胞外小泡樣本中，有67個上調(diào)的miRNAs，157個下調(diào)的miRNAs。隨后預(yù)測了差異表達miRNAs靶向的幾個基因或通路，其中凋亡過程中的細胞凋亡蛋白酶(Caspase)受gga-miR-1784b-5p的調(diào)控，gga-miR-205b參與調(diào)控mRNA加工、p53轉(zhuǎn)錄因子和Ras-相關(guān)C3肉毒毒素底物1(RAC1)途徑，gga-miR-282-5p參與了促癌基因(c-myc)途徑。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)了26種miRNAs可以靶向病毒基因組片段，如gga-miR-1784b-5p可以靶向H4N6病毒片段5(NP蛋白)和片段7(M1蛋白)。 這與Wang等[42]的研究結(jié)果一致。

DC的抗原遞呈能力在識別和清除病毒方面發(fā)揮著不可替代的重要作用。Lin等[44]通過全基因組miRNAs圖譜揭示了H9N2 AIV與禽DC的相互作用,發(fā)現(xiàn)H9N2 AIV的活性和非活性均增強了DC遞呈抗原和激活T淋巴細胞的能力。其次，通過全基因芯片分析表明，H9N2 AIV刺激涉及蛋白質(zhì)定位、核苷酸結(jié)合、白細胞內(nèi)皮細胞遷移和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，該研究還證明了gga-miR-1644可以靶向肌盲蛋白2(MBNL2)以增強DC抑制病毒復(fù)制的能力，gga-miR-6675靶向PB1的核定位序列以觸發(fā)PB1基因的沉默，從而抑制H9N2 AIV的復(fù)制。Yang等[45]通過分析H9N2 AIV感染DC后的miRNAs表達譜發(fā)現(xiàn)66個已知miRNAs和36個新miRNAs在感染后差異表達，其中72個上調(diào)，30個下調(diào)。對預(yù)測靶基因的GO富集分析顯示，在細胞過程、蛋白質(zhì)修飾過程、MAPK級聯(lián)反應(yīng)、對刺激的反應(yīng)、蛋白質(zhì)代謝等過程顯著富集。KEGG分析表明，這些miRNAs的預(yù)測靶點在內(nèi)吞、溶酶體、p53、Rig-I樣受體和Nod樣受體信號通路中顯著富集。這些大多與DC促進感知入侵的病毒并且參與宿主抵御病原感染的第一道防線相關(guān)。

3 細菌感染后雞體miRNAs的調(diào)控

3.1 腸炎沙門氏菌感染

腸炎沙門氏菌病是一種重要的食源性疾病之一，動物及動物性產(chǎn)品包括蛋、奶、奶制品均可能是腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis，SE)的載體，對人類健康造成威脅。Wu等[5]通過深度測序方法分析了SE感染白來航蛋雞后盲腸miRNAs的表達，發(fā)現(xiàn)了37個差異表達的miRNAs，其中22個表達上調(diào)，15個表達下調(diào)。 通過對差異表達的miRNAs預(yù)測的靶基因進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，大多靶基因富集在免疫和代謝相關(guān)功能。說明在產(chǎn)蛋初期，miRNAs主要通過調(diào)節(jié)代謝和免疫之間的動態(tài)平衡，參與雞體對SE感染的應(yīng)答。

SE感染不同抗性和易感性雞群時，雞體的miRNAs調(diào)控途徑具有不同的趨向性。Li等[46]通過高通量測序技術(shù)研究了SE易感組、抵抗組和對照組雞脾臟miRNAs的表達，鑒定出32個差異表達的miRNAs，易感組和對照組之間有16個，抵抗組和對照組之間有13個，易感組和抵抗組之間有13個。對靶基因進行富集分析顯示，細胞凋亡和NOD樣受體(Nod-like receptor protein，NLRP)信號通路及獲得性免疫應(yīng)答明顯豐富，且易感組與對照組相比凋亡途徑顯著豐富，抵抗組與對照組相比NOD樣受體途徑顯著富集。此外，通過熒光素酶報告基因系統(tǒng)，證明了gga-miR-101-3p和gga-miR-155可以分別靶向免疫相關(guān)基因干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF4)和富含亮氨酸的重復(fù)序列蛋白59(LRRC59)的3′-UTR，從而負反饋促炎細胞因子的產(chǎn)生。

3.2 禽致病性大腸桿菌感染

禽致病性大腸桿菌病是雞群中最常見的細菌性疾病之一，主要通過呼吸道在雞群傳播，引起不同年齡雞的急性和慢性感染。與SE感染時相似，禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)感染不同抗性和易感性雞群時，雞體的miRNAs調(diào)控也具有差異。Jia等[47]通過高通量測序和整合分析鑒定易感組、抵抗組和對照組肉雞脾臟miRNAs的表達，共鑒定出27個差異表達的miRNAs，其中13個在對照組與抵抗組之間、17個在對照組與易感組之間、14個在抵抗組與易感組之間。在這些差異表達的miRNAs中g(shù)ga-miR-429的表達水平持續(xù)上調(diào)，抵抗組約為對照組的1.4倍，易感組約為抵抗組的2.3倍，因此，gga-miR-429可能與雞對APCE的抗性有關(guān)。miRNAs的最終功能依賴于靶基因的活性，通過對靶基因的潛在功能分析，這些基因在12個與免疫相關(guān)的過程顯著富集。說明在APEC感染過程中，雞脾臟中差異表達的miRNAs可以對免疫相關(guān)靶點進行調(diào)控。Jia等[47]通過熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證了gga-miR-429可以靶向跨膜蛋白(TMEFF2)的3′-UTR，在體外HD11巨噬細胞系中過表達gga-miR-429，顯著抑制TMEFF2的表達，而TMEFF2參與脂多糖誘導(dǎo)的Wnt信號通路。該結(jié)果表明，gga-miR-429參與感染過程，是一個潛在的、新的與APEC抗性相關(guān)的基因。

宋祥軍等[48]通過分析感染APEC的雛雞脾臟miRNAs表達譜，鑒定出21個差異表達的miRNAs，其中差異表達的gga-miR-1416-5p和gga-miR-1662在Wu等[5]鑒定的SE感染的雞盲腸miRNAs中也被發(fā)現(xiàn)，說明這2個miRNAs在雞體內(nèi)組織特異性較低，可以在不同細菌感染時廣泛調(diào)控相關(guān)基因的表達，以應(yīng)對病原感染。

3.3 空腸彎曲菌感染

雞是空腸彎曲菌(campylobacter jejuni)的天然宿主，盲腸是其定植感染的主要場所，盲腸扁桃體作為雞體最重要的免疫器官，在病原入侵后必然發(fā)揮重要的免疫功能。Liu等[49]通過Solexa測序分析雞盲腸miRNAs在接種空腸彎曲菌后的變化，發(fā)現(xiàn)了4個差異表達的miRNAs:gga-miR-155、gga-miR-1416-5p、gga-miR-19a-3p和gga-miR-19b-3p;通過生物學(xué)軟件預(yù)測的1 114個靶基因在14條通路中顯著富集，其中有5種免疫相關(guān)通路，包括MAPK信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路、Wnt信號通路、胰島素信號通路和Jak-STAT信號通路。

病原感染雞后，miRNAs及其功能靶點會隨時間的改變發(fā)生動態(tài)的變化。Wang等[50]通過實時熒光定量PCR分析了空腸彎曲菌感染后4、8、12、16、20和24 h雞盲腸miRNAs與靶基因的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，gga-miR-1416-5p在感染后8 h表達顯著上調(diào)，在20 h表達顯著下調(diào)；gga-miR-30b和gga-miR-30c表達模式一致，在感染后8 h表達顯著上調(diào)，24 h表達顯著下調(diào)。表明gga-miR-30家族在抗菌感染中發(fā)揮重要作用，可能協(xié)同抑制空腸彎曲桿菌的增殖。此外，SOCS3在感染后8 h的調(diào)控方向與gga-miR-30b、gga-miR-30c、gga-miR-148a、gga-miR-1416-5p相反，表明SOCS3是這些miRNAs的潛在靶基因。

4 球蟲感染后雞體miRNAs的調(diào)控

由于在寄生蟲方面僅有球蟲與雞體miRNAs相互作用的研究報道，所以作者僅對球蟲感染后雞體miRNAs的調(diào)控進行了綜述。雞球蟲病是由雞球蟲引起的，在雞群中最常見的寄生蟲病，主要引起腸道黏膜的炎癥病變，其病變部位差異表達的miRNAs大多參與細胞生長發(fā)育、免疫反應(yīng)等過程。Hong等[6]通過分析壞死性腸炎抗性和敏感品系雞混合感染巨型艾美耳球蟲和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌后脾臟和腸上皮淋巴細胞(IEL)miRNAs和轉(zhuǎn)錄組表達情況。在2個品系脾臟和IEL中發(fā)現(xiàn)gga-miR-30b、gga-miR-30c和gga-miR-455-5p與SOCS3轉(zhuǎn)錄水平相反;Ⅰ型膠原蛋白α2(COL1A2)轉(zhuǎn)錄水平與gga-miR-196和gga-let-7之間，以及可溶性蛋白質(zhì)(Calbindin-D28k,CALB1)轉(zhuǎn)錄水平和gga-miR-130b之間，也觀察到類似的負調(diào)控;在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的趨化因子配體14(CXCL14)的轉(zhuǎn)錄水平只與2個品系脾臟中g(shù)ga-miR-181a和gga-miR-181b呈負相關(guān)。此外，該研究通過對差異表達miRNAs的免疫相關(guān)靶基因進行了生物學(xué)過程和通路分析，生物學(xué)過程主要集中在炎癥反應(yīng)、免疫性疾病或癌癥、細胞發(fā)育，細胞生長和增殖、血液系統(tǒng)發(fā)育和功能、組織形態(tài)、體液免疫反應(yīng)等；顯著富集的通路途徑包括Ⅰ型糖尿病信號傳導(dǎo)、肝纖維化/肝星狀細胞活化、輔助T細胞分化、JAK2在激素樣細胞因子信號傳導(dǎo)中的作用以及IL-6信號傳導(dǎo)等。

在球蟲感染和炎癥期間，腸道中常發(fā)生細胞增殖。膽固醇作為細胞膜的基本成分，是細胞增殖和生長所必需的。Sun等[51]通過分析堆型艾美耳球蟲感染的十二指腸miRNAs表達譜，發(fā)現(xiàn)gga-miR-1699、gga-miR-7477-5p、gga-miR-1451-5p和gga-miR-1608表達顯著增加與CYP27A1表達下調(diào)；通過雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)，驗證了gga-miR-1608和gga-miR-1699可以靶向CYP27A1基因的3′-UTR;下調(diào)的CYP27A1蛋白降低了腸道中膽固醇的代謝水平，這可能是為了促進球蟲感染誘導(dǎo)的炎癥過程中上皮細胞的增殖。

之后的一項研究似乎支持了Hong等[6]和Sun等[51]的試驗結(jié)果，即球蟲感染后，會激活部分miRNAs參與調(diào)控腸道炎癥部位的細胞增殖，以應(yīng)對球蟲感染。Liu等[52]通過高通量測序方法鑒定了毒害艾美耳球蟲感染后108 h雞小腸的miRNAs表達情況，鑒定出了35個差異表達的miRNAs，其中16個上調(diào)，19個下調(diào);通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測差異表達miRNAs的靶基因，對靶基因進行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)了一些與細胞增殖和凋亡相關(guān)的通路，如MAPK信號通路和過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)信號通路,其中差異表達的gga-miR-1453、gga-miR-1464、gga-miR-34a-5p、novel-100-mature、novel-78-mature的靶基因參與了細胞分化和細胞黏附，表明這些差異表達miRNAs在細胞發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。此外，差異表達的gga-miR-1453、gga-miR-1464、novel-188-mature、novel-271-mature和novel-78-mature預(yù)測的靶基因顯著集中在Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號通路和腫瘤壞死因子(TNF)信號通路，這2個通路已被鑒定為宿主抗艾美耳球蟲感染的重要途徑[53-54]。

宿主miRNAs還可以作為禽病早期的診斷標(biāo)志物。Tim等[55]利用NextSeq500測序技術(shù)，比較了自然感染和亞臨床感染巨型和堆型艾美耳球蟲的羅斯308肉雞腸道中miRNAs的表達，發(fā)現(xiàn)gga-miR-31-5p僅在臨床感染組中差異表達，gga-miR-122-5p在臨床和亞臨床感染雞中差異表達，gga-miR-144-5p和gga-miR-205b僅在亞臨床感染雞中差異表達。綜合上述研究結(jié)果，確定gga-mir-122-5p、gga-miR-144-5p和gga-miR-205b可以用于診斷羅斯308肉雞的亞臨床巨型和堆型艾美耳球蟲病。

5 小 結(jié)

病原微生物感染雞體是一個非常復(fù)雜的對抗過程，既包括雞體通過免疫系統(tǒng)清除病原微生物，又包括病原微生物對雞體的侵害。宿主miRNAs作為一種參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的小分子RNA，在病原感染過程中發(fā)揮著重要作用。病原侵入后，雞體miRNAs可以靶向自身的基因來調(diào)控雞體先天免疫信號，也可以靶向病原的基因從而影響病原的吸附、侵入、增殖。但同時，宿主miRNAs的變化不止是有利于雞體的，也可能是有利于病原的，如IBDV體外感染DF-1，gga-miR-2127和gga-miR-9*可促進IBDV的復(fù)制。不同病原微生物感染雞后，會激活相同的miRNAs調(diào)控途徑，如gga-miR-32、gga-miR-30b、gga-miR-155和gga-miR-1416等在部分病毒、細菌、寄生蟲感染雞后均被檢測為差異表達的miRNAs。此外，宿主miRNAs還可以作為禽病早期的診斷標(biāo)志物，如gga-miR-122-5p、gga-miR-144-5p和gga-miR-205b可以用于診斷羅斯308肉雞的亞臨床巨型和堆型艾美爾球蟲病。目前，對宿主miRNAs的研究還只是冰山一角，一些宿主miRNAs的功能、靶點和作用機制還需要進一步的研究。了解雞miRNAs在病原感染和致病過程中的作用機制，有助于為雞病的診斷、治療和防控提供新的思路和理論依據(jù)。