復(fù)方七芍降壓片對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎動(dòng)脈重塑的影響

曾勇， 文愛珍， 符艷， 柳玉佳， 李弘， 范伏元， 游海

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙 410208）

高血壓病是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見心血管系統(tǒng)疾病，我國成人高血壓病患病率達(dá)到27.9%[1]。隨著研究的不斷深入，高血壓病不再被認(rèn)為僅僅是血液動(dòng)力學(xué)的改變，而是伴隨著炎癥水平上升和心血管重塑等的病理過程[2]。血管重塑是高血壓病靶器官損害的病理基礎(chǔ)，也是患者心血管事件發(fā)生率和死亡率上升的主要原因[3]。因此，開發(fā)有效治療高血壓病血管重塑的藥物具有重要的臨床意義。中醫(yī)藥立足于辨證論治，可多層次、多靶點(diǎn)進(jìn)行整體調(diào)節(jié)，且作用溫和、療效確切，在高血壓病血管重塑的防治中，其作用受到越來越多的關(guān)注。高血壓病歸屬于中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”的范疇。復(fù)方七芍降壓片具有養(yǎng)陰柔肝、活血通脈的功效，前期研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方七芍降壓片能降低高血壓患者及自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血壓[4]，對(duì)SHR血管重塑有較好的調(diào)節(jié)作用[5-6]，但其具體機(jī)制尚不清楚。本研究以SHR 為研究對(duì)象，采用在體實(shí)驗(yàn)，探討復(fù)方七芍降壓片干預(yù)逆轉(zhuǎn)SHR 腎動(dòng)脈重塑的可能機(jī)制。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1. 1動(dòng)物SPF 級(jí)雄性SHR 30 只，6 ～7 周齡，體質(zhì)量130 ～150 g；SPF 級(jí)雄性WKY 大鼠10 只，6 ～7 周齡，體質(zhì)量130～150 g。均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：11400700359571；動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-006；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)：SYXK（湘）2015-0003。

1.2 藥物復(fù)方七芍降壓片由三七、白芍、天麻、丹參、桑寄生、杜仲、羅芙木、地龍、葛根、炒香附、甘草組成，0.46 g/片，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備，批號(hào)：20181026，人臨床日用量為12 片，相當(dāng)于含生藥量97 g；厄貝沙坦片，75 mg/片，由揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：17122111，人臨床日用量為300 mg。

1. 3試劑與儀器Ⅰ型膠原（COⅠ）、Ⅲ型膠原（COⅢ）抗體（北京Bioss公司）；免疫球蛋白（IgG）-辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體（長沙麗欣生物有限公司）。H1850型低速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀儀器有限公司）；超低溫冰箱（杭州旭清科技有限公司）；BMJ-1n型病理組織包埋機(jī)和包埋冷凍臺(tái)（上海珂淮儀器有限公司）；TS-12F 型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（上海華巖儀器設(shè)備有限公司）；LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)（廣州華俊科技有限公司）；倒置顯微鏡和照相裝置（日本Olympus公司）；KS400 型圖像分析儀（德國Zisse公司）。

1.4 分組與給藥30只SHR根據(jù)給藥前血壓和體質(zhì)量，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、厄貝沙坦片組、復(fù)方七芍降壓片組，每組10 只；另設(shè)10 只WKY 大鼠為正常對(duì)照組。厄貝沙坦片組給予相當(dāng)于臨床等效劑量的厄貝沙坦片混懸液（27 mg·kg-1·d-1）灌胃；復(fù)方七芍降壓片組給予相當(dāng)于臨床等效劑量的復(fù)方七芍降壓片混懸液（496.8 mg·kg-1·d-1）灌胃；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積蒸餾水（10 mL·kg-1）灌胃。每天1 次，連續(xù)給藥6周。每周測量1次血壓和體質(zhì)量，根據(jù)每周體質(zhì)量調(diào)整下周給藥量。

1.5 蘇木素-伊紅染色法觀察腎動(dòng)脈組織病理形態(tài)麻醉大鼠后，開腹，迅速分離腎動(dòng)脈，生理鹽水沖洗干凈，于40 g/L多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，浸蠟包埋，切厚度為4 μm 的切片，蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察、拍照。運(yùn)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測量管壁厚度、血管中膜厚度及相同位置的管腔直徑，計(jì)算血管中膜厚度與管腔直徑的比值。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測腎動(dòng)脈組織COⅠ、COⅢ表達(dá)蠟塊常規(guī)切片，脫蠟至水，分別加入COⅠ、COⅢ抗體孵育（37 ℃，2 h），IgG-HRP標(biāo)記抗體孵育30 min。DAB 顯色，脫水封片，于光鏡顯微鏡下拍照，并釆用MOTIC 圖像分析軟件對(duì)所取圖片定量分析，測定陽性反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度，COⅠ、COⅢ陽性著色表現(xiàn)為散在或片狀的棕黃色或棕褐色顆粒。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組比較采用重復(fù)測量方差分析和單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎動(dòng)脈組織病理形態(tài)學(xué)比較經(jīng)藥物干預(yù)6周后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠的腎動(dòng)脈內(nèi)膜粗糙不平，甚至有內(nèi)膜脫落情況，平滑肌細(xì)胞數(shù)量增加、分布不均勻、排列紊亂；與模型對(duì)照組比較，厄貝沙坦片組大鼠腎動(dòng)脈內(nèi)膜欠平整，無明顯內(nèi)膜脫落情況，血管平滑肌細(xì)胞數(shù)量增多、分布不均勻、排列不同程度紊亂，而復(fù)方七芍降壓片組大鼠腎動(dòng)脈內(nèi)膜欠平整，無內(nèi)膜脫落情況，血管平滑肌細(xì)胞數(shù)量無增多、分布尚均勻、排列無明顯紊亂。具體結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，復(fù)方七芍降壓片能夠改善高血壓大鼠受損的腎動(dòng)脈組織形態(tài)。

圖1 各組大鼠腎動(dòng)脈組織病理形態(tài)學(xué)特征比較（HE染色法，×400）Figure 1 Comparison of pathemorphological features of renal artery between various groups of rats（by HE staining method，×400）

將獲得的圖片應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測量其血管管壁厚度、中膜厚度及相同位置的管腔直徑，并計(jì)算后二者比值。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血管管壁厚度、中膜厚度/管腔直徑比值明顯升高（P＜0.01）；藥物干預(yù)后，與模型對(duì)照組比較，厄貝沙坦片組和復(fù)方七芍降壓片組大鼠血管管壁厚度、中膜厚度/管腔直徑比值明顯降低（P＜0.05）。具體結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠腎動(dòng)脈管壁厚度和中膜厚度/管腔直徑比值比較Table 1 Comparison of renal arterial wall thickness and ratio of mid-membrane thickness/lumen diameter between various groups of rats （±s，n=3）

表1 各組大鼠腎動(dòng)脈管壁厚度和中膜厚度/管腔直徑比值比較Table 1 Comparison of renal arterial wall thickness and ratio of mid-membrane thickness/lumen diameter between various groups of rats （±s，n=3）

①P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對(duì)照組比較

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組厄貝沙坦片組復(fù)方七芍降壓片組中膜厚度/管腔直徑比值0.221±0.036 0.545±0.119①0.385±0.015②0.358±0.017②鼠數(shù)/只10 10 10 10管壁厚度/μm 422.938±63.772 631.120±13.939①513.410±50.865②440.585±18.748②中膜厚度/μm 91.241±14.911 105.323±12.915①116.669±28.941②109.046±20.190②管腔直徑/μm 421.422±94.994 225.303±77.544①303.489±61.249③297.017±57.096③

2.2 各組大鼠腎動(dòng)脈中COⅠ、COⅢ蛋白表達(dá)的比較光鏡下可見：正常對(duì)照組大鼠腎動(dòng)脈組織呈弱陽性染色，內(nèi)膜光滑；模型對(duì)照組大鼠腎動(dòng)脈組織呈強(qiáng)陽性染色，內(nèi)膜損傷明顯，平滑肌細(xì)胞數(shù)目增多，排列紊亂；厄貝沙坦片組和復(fù)方七芍降壓片組大鼠腎動(dòng)脈組織呈弱陽性染色，內(nèi)膜損傷較模型對(duì)照組得到改善。COⅠ、COⅢ陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿。結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠腎動(dòng)脈COⅠ陽性表達(dá)的比較（免疫組織化學(xué)法，×400）Figure 2 Comparison of COⅠpositive expression in renal artery between various groups of rats（by immunohistochemistry，×400）

圖3 各組大鼠腎動(dòng)脈COⅢ陽性表達(dá)的比較（免疫組織化學(xué)法，×400）Figure 3 Comparison of COⅢpositive expression in renal artery between various groups of rats（by immunohistochemistry，×400）

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腎動(dòng)脈中COⅠ、COⅢ蛋白表達(dá)的平均光密度均明顯增加（P＜0.01）；藥物干預(yù)后，與模型對(duì)照組比較，厄貝沙坦片組和復(fù)方七芍降壓片組大鼠腎動(dòng)脈中COⅠ、COⅢ蛋白表達(dá)的平均光密度均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠腎動(dòng)脈CO I和CO Ⅲ平均光密度值的比較Table 2 Comparison of mean optical density values of CO I and CO Ⅲin renal artery between various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠腎動(dòng)脈CO I和CO Ⅲ平均光密度值的比較Table 2 Comparison of mean optical density values of CO I and CO Ⅲin renal artery between various groups of rats （±s）

①P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對(duì)照組比較

COⅢ0.391±0.042 0.436±0.034①0.397±0.088③0.415±0.066③組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組厄貝沙坦片組復(fù)方七芍降壓片組鼠數(shù)/只10 10 10 10 COⅠ0.504±0.060 0.530±0.054①0.526±0.030②0.529±0.035③

3 討論

高血壓病引發(fā)的血管重塑進(jìn)一步發(fā)展會(huì)導(dǎo)致一系列的靶器官損傷[7]。小動(dòng)脈、微動(dòng)脈和毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)與功能改變也是心腦血管疾病形成靶器官損害的重要病理基礎(chǔ)[8]。而腎動(dòng)脈作為阻力血管，其功能和結(jié)構(gòu)改變會(huì)誘導(dǎo)血管重塑的發(fā)生，造成血液中舒血管活性物質(zhì)的減少，使血壓進(jìn)一步升高，出現(xiàn)靶器官損傷，形成惡性循環(huán)[9]，且這種表現(xiàn)比主動(dòng)脈表現(xiàn)得更加顯著[10]。而厄貝沙坦降壓的同時(shí)可以改善血管重塑[11]。因此，本研究以厄貝沙坦片為陽性對(duì)照藥，針對(duì)SHR 腎動(dòng)脈的重塑機(jī)制及中藥干預(yù)作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

血管重塑最典型的特征為內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，血管中膜平滑肌細(xì)胞（VSMC）增生和外膜細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）COⅠ、COⅢ等沉積。VSMC 發(fā)生增生、肥大和向內(nèi)膜遷移時(shí)，會(huì)造成血管壁肥厚、管腔減小，這是導(dǎo)致血管重塑的關(guān)鍵機(jī)制之一[12]。在生理狀態(tài)下，VSMC 通常處于收縮型的靜止?fàn)顟B(tài)；當(dāng)處于高血壓等病理狀態(tài)時(shí)，VSMC會(huì)由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，呈現(xiàn)高增殖速率、遷移率，導(dǎo)致管腔比率下降，中膜比率升高，引發(fā)血管重塑[13-15]。高血壓病整個(gè)病程中伴隨著血管重塑。早期由于體內(nèi)交感神經(jīng)末梢合成、釋放去甲腎上腺素增多，小動(dòng)脈（如腎動(dòng)脈）平滑肌細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性降低，胞內(nèi)游離Ca2+水平升高，表現(xiàn)為小動(dòng)脈平滑肌對(duì)各種刺激反應(yīng)性增強(qiáng)，引起小動(dòng)脈重塑，隨著病程進(jìn)展合并出現(xiàn)中、大動(dòng)脈血管重塑[16]。本研究通過HE 染色觀察，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腎動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，中膜VSMC 數(shù)量增加、排列紊亂，管壁肥厚，管腔減小，提示處于高血壓等病理狀態(tài)時(shí)，腎動(dòng)脈管壁肥厚、管腔減小，可能引發(fā)動(dòng)脈重塑。給予復(fù)方七芍降壓片干預(yù)后，上述現(xiàn)象得到了改善。通過免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腎動(dòng)脈中COⅠ、COⅢ表達(dá)水平均升高，提示高血壓腎動(dòng)脈管壁中COⅠ、COⅢ膠原產(chǎn)生，導(dǎo)致血管重塑。復(fù)方七芍降壓片干預(yù)后，與模型對(duì)照組比較，大鼠腎動(dòng)脈COⅠ、COⅢ表達(dá)水平均降低，提示復(fù)方七芍降壓片可減少膠原生成，緩解血管重塑。

綜上所述，復(fù)方七芍降壓片可改善SHR 腎動(dòng)脈重塑，抑制腎動(dòng)脈重塑的機(jī)制與抑制平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移及COⅠ、COⅢ膠原蛋白沉積有關(guān)。