蟬芩顆粒含藥血清對脂多糖誘導人支氣管上皮細胞神經(jīng)源性炎癥的干預機制

陳侃俊， 趙源， 石煒弘， 竇丹波， 呂俊， 余小萍， 沈若冰

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203；3.上海市浦東新區(qū)老年醫(yī)院，上海 201314）

感染后咳嗽（post infectious cough）是亞急性咳嗽主要病因之一[1]，占亞急性咳嗽病因的48.4%，發(fā)病率高，上呼吸道感染的患者11%～25%會發(fā)生感染后咳嗽[2]。感染后咳嗽的發(fā)生機制尚未明確，隨著廣泛分布于呼吸道的速激肽網(wǎng)的發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)源性炎癥在感染后咳嗽機制中的作用也逐漸成為研究熱點之一[3]。研究顯示，激活的誘導型一氧化氮 合 酶（iNOS）/一 氧 化 氮（NO）-環(huán) 磷 酸 鳥 苷（cGMP）-cGMP 依賴性蛋白激酶（PKG）信號通路及瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1），可導致P 物質(zhì)（SP）等速激肽釋放，在神經(jīng)源性炎癥中起重要作用[4-5]。蟬芩顆粒是上海市名中醫(yī)黃吉賡教授的治咳經(jīng)驗方。臨床研究表明，蟬芩顆粒治療風邪戀肺型感染后咳嗽患者有較好的療效[6]。前期實驗研究[7]表明，蟬芩顆粒可減輕感染后咳嗽大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥，機制可能與下調(diào)TRPV1 蛋白表達、減少速激肽釋放有關，其上游機制尚不明確。網(wǎng)絡藥理學研究表明，iNOS 可能是蟬芩顆粒治療感染后咳嗽的潛在靶點[8]。因此，本研究通過體外實驗，選擇人支氣管上皮細胞16HBE 作為研究對象，以脂多糖（LPS）誘導構(gòu)建神經(jīng)源性炎癥細胞模型，觀察蟬芩顆粒對模型細胞iNOS/NOcGMP-PKG 信號通路作用的影響，為該方應用于感染后咳嗽提供分子生物學依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞人支氣管上皮細胞16HBE，購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：CL-0249。

1.2 藥物與試劑蟬芩顆粒（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院藥劑科制備，批號：200401，14 g/包，主要成分：僵蠶、柴胡、黃芩、竹瀝半夏、生甘草等）。LPS、N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）（美國Sigma 公司）；胎牛血清（美國Gibco 公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8，日本同仁株式會社）；TRIzol RNA 提取試劑（美國Thermo Fisher 公司）；逆轉(zhuǎn)錄PCR 試劑盒、熒光定量SYBR Green試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；iNOS 抗體（英國Abcam 公司）；可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）抗體（英國Abcam公司）；PKG抗體（美國Proteintech 公司）；β-actin抗體（英國Abcam公司）；鈣離子熒光探針（日本同仁株式會社）。

1.3 儀器PCR儀（美國ABI公司，型號：7500）；顯微鏡（日本Olympus 公司，型號：BX51TF）；酶標儀（美國Rayto 公司，型號：RT-6000）；Mini Trans-Blot垂直電泳儀系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號：1703930）； CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo 公司，型號：XD-101）；Cary Eclipse 分光光度計（美國安捷倫公司）。

1.4 蟬芩顆粒含藥血清的制備與保存

1. 4. 1 實驗動物 16 只SPF 級SD 大鼠，體質(zhì)量180 ～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005。將16 只大鼠隨機分為空白組與蟬芩顆粒高、中、低劑量組，每組4只。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（滬）2020-0009，溫度（22±2）℃，相對濕度50%～60%，12 h光照。研究內(nèi)容與過程中涉及的實驗動物，均符合國家對醫(yī)學實驗動物的有關要求，倫理批準編號：PZSHUTCM211115014。

1.4.2 灌胃與血清采集 按照中藥血清藥理學方法[9-10]，蟬芩顆粒高、中、低劑量組大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后開始灌胃給藥。蟬芩顆粒成人（按60 kg體質(zhì)量計算）給藥劑量是84 g/d，大鼠給藥劑量按“人和動物體表面積折算的等效劑量比值表”換算，為17.6 g·kg-1·d-1（高劑量）、8.8 g·kg-1·d-1（中劑量）、4.4 g·kg-1·d-1（低劑量）。空白組灌胃等體積生理鹽水。各組大鼠均按照每次1 mL 灌胃，每日早晚2次，連續(xù)3 d。于末次灌藥后1 h，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，無菌條件下分離、暴露腹主動脈，取血，置于4 ℃冰箱中靜置1 h 后，以3 000 r/min（離心半徑為3 cm）離心20 min，無菌收集血清，同組血清混合。將4 組血清置于56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾，密封，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細胞培養(yǎng)16HBE 細胞，以含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基（其中含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），置于37 ℃5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞大部分融合并基本長滿瓶底后，2.5 g/L 胰蛋白酶消化傳代。選取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.6 細胞分組與干預

1.6.1 細胞分組 按隨機數(shù)字表將細胞分為6組：空白組，模型組，蟬芩顆粒高、中、低劑量組，L-NAME（iNOS抑制劑）組。

1.6.2 細胞干預 空白組：加入含10%空白血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。模型組：給予LPS（1 μg/mL，12 h，預實驗獲得LPS 最佳損傷濃度及時間）+含10%空白血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。蟬芩顆粒高、中、低劑量組和L-NAME 抑制劑組在加入模型組相同量的LPS 基礎上，分別對應加入10%高、中、低劑量蟬芩顆粒含藥血清及L-NAME 0.1 mmol/L（LPS干預前預處理1 h）[11-12]。各組干預12 h后收集細胞備用。

1.7 檢測指標與方法

1. 7. 1 CCK-8 法檢測16HBE 細胞活力 取處于對數(shù)生長期的16HBE 細胞，使用胰酶進行消化，按8×103個/mL細胞接種于96孔板中，每組設3個復孔。細胞貼壁后，同步化培養(yǎng)24 h，再給予相應藥物干預后繼續(xù)培養(yǎng)12 h。吸棄培養(yǎng)基，更換為10%CCK-8稀釋液，100 μL/孔，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)后應用酶標儀450 nm 波長檢測各孔吸光度（OD）值。細胞活力（%）=（實驗孔OD值-空白孔OD值）/（對照孔OD值-空白孔OD值）×100%。

1.7.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測16HBE 細胞iNOS、sGC、PKG、TRPV1、SP、IL-6、IL-1β、ICAM-1的mRNA表達 采用TRIzol法提取各組細胞總RNA，按試劑盒說明書合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參進行熒光定量PCR擴增以檢 測 各 組 中iNOS、sGC、PKG、TRPV1、SP、IL-6、IL-1β、ICAM-1 mRNA 的表達水平。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火55 s，72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)。引物由金唯智公司合成。引物序列見表1。各組均設3 個復孔。用2-△△CT法計算目的基因mRNA 的相對表達水平。

表1 PCR引物序列Table 1 The PCR primer sequences

1.7.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測16HBE細胞iNOS、sGC、PKG 的蛋白表達 取各組細胞，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）細胞裂解液，冰上裂解30 min 后，離心收集上清，二喹啉甲酸（BCA）法測定細胞總蛋白濃度。加入制備好的電泳液，上樣量為每泳道30 μg，濃縮膠電泳電壓80 V，分離膠電泳電壓120 V，當溴酚藍遷移至分離膠下緣時，停止電泳。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。加入50 g/L 脫脂奶粉的封閉液，于搖床上室溫封閉1.5 h。用TBST 洗膜3 次，每次10 min，分別加入稀釋好的一抗iNOS抗體（1∶10 000）、SGC 抗體（1∶1 000）、PKG 抗體（1∶2 000）、β-actin 抗體（1∶1 000），4 ℃反應過夜。次日先以TBST 洗膜3 次，每次10 min，后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG（1∶5 000）或羊抗鼠IgG（1∶10 000），室溫搖床振蕩反應2 h。再用TBST 洗膜3 次，每次10 min。按電化學發(fā)光（ECL）試劑盒說明進行顯影。應用ImageJ軟件進行灰度分析，以目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1. 7. 4 熒光分光光度法檢測16HBE 細胞[Ca2+]i水平 細胞分組并干預后，使用PBS 溶液漂洗3 次，除去培養(yǎng)基，加入熒光探針Fluo-4 AM 工作液（終濃度5 μmol/L），溶液量以能充分覆蓋細胞為準。避光37 ℃負載40 min。隨后用PBS 溶液漂洗3 次，再避光37 ℃繼續(xù)孵育20 min，以保證Fluo-4 AM在細胞內(nèi)被充分轉(zhuǎn)變?yōu)镕luo-4。使用熒光分光光度計檢測Fluo-4 熒光強度，以確定細胞內(nèi)鈣離子濃度變化。激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為520 nm。

1.8 統(tǒng)計方法所有實驗均設置3 次重復。所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件包處理，實驗數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差（±s）。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），若方差不齊，采用Dunnett’s T3 檢驗分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計圖表使用Graphpad Prism 5 軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 蟬芩顆粒含藥血清對LPS誘導16HBE細胞活力的影響CCK-8 法檢測各組細胞的活力，結(jié)果顯示：與空白組比較，LPS 處理后16HBE 細胞活力顯著降低（P＜0.01）；高劑量蟬芩顆粒及L-NAME 可恢復LPS 誘導16HBE 細胞活力的下降（P＜0.05），中、低劑量蟬芩顆粒無明顯作用（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖1。

圖1 各組16HBE細胞活力比較Figure 1 Comparison of 16HBE cell viability between various groups

2.2 蟬芩顆粒含藥血清對LPS誘導16HBE細胞信號分子iNOS、sGC、PKG，TRPV1通道，神經(jīng)源性炎癥相關炎癥因子SP、IL-6、IL-1β、ICAM-1 mRNA表達的影響應用RT-qPCR 法檢測各組細胞中iNOS、sGC、PKG的mRNA表達水平，結(jié)果顯示，LPS 誘導上調(diào)了16HBE 細胞中iNOS、sGC、PKG 的mRNA 表達水平（P＜0.01），而高劑量蟬芩顆粒及L-NAME 有效抑制了LPS 誘導16HBE 細胞中iNOS、sGC、PKG mRNA表達的升高（P＜0.01），蟬芩顆粒中劑量有效抑制了LPS誘導16HBE細胞中iNOS、sGC mRNA的升高（P＜0.05或P＜0.01），蟬芩顆粒低劑量則無顯著性效果（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖2 ～圖4。

圖2 各組16HBE細胞中iNOS mRNA表達水平比較Figure 2 Comparison of the mRNA expression level of iNOS between various groups of 16HBE cells

圖3 各組16HBE細胞中sGC mRNA表達水平比較Figure 3 Comparison of the mRNA expression level of sGC between various groups of 16HBE cells

圖4 各組16HBE細胞中PKG mRNA表達水平比較Figure 4 Comparison of the mRNA expression level of PKG between various groups of 16HBE cells

RT-qPCR 檢測各組細胞中TRPV1 mRNA 的表達水平，結(jié)果顯示，LPS 誘導上調(diào)了16HBE 中TRPV1 mRNA 的表達水平（P＜0.01），而高、中劑量蟬芩顆粒及L-NAME 有效抑制了LPS 誘導16HBE 細胞中TRPV1 mRNA 的升高（P＜0.05 或P＜0.01），蟬芩顆粒低劑量無顯著性效果（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖5。

圖5 各組16HBE細胞中TRPV1 mRNA表達水平比較Figure 5 Comparison of the mRNA expression level of TRPV1 between various groups of 16HBE cells

RT-qPCR 檢測各組細胞中SP、IL-6、IL-1β、ICAM-1mRNA 的表達水平，結(jié)果顯示，LPS 誘導上 調(diào) 了16HBE 中SP、IL-6、IL-1β、ICAM-1 mRNA 的表達水平（P＜0.01），而高劑量蟬芩顆粒及L-NAME 均有效抑制了LPS 誘導16HBE 細胞中SP、IL-6、IL-1β、ICAM-1 mRNA 表達的升高（P＜0.01），中劑量蟬芩顆粒有效抑制了LPS 誘導16HBE細胞中SP、IL-6、ICAM-1 mRNA表達的升高（P＜0.05 或P＜0.01），低劑量蟬芩顆粒抑制了SP mRNA 表達的升高（P＜0.01）。具體結(jié)果見圖6 ～圖9。

圖6 各組16HBE細胞中SP mRNA表達水平比較Figure 6 Comparison of the mRNA expression level of SP between various groups of 16HBE cells

圖7 各組16HBE細胞中IL-6 mRNA表達水平比較Figure 7 Comparison of the mRNA expression level of IL-6 between various groups of 16HBE cells

圖8 各組16HBE細胞中IL-1β mRNA表達水平比較Figure 8 Comparison of the mRNA expression level of IL-1β between various groups of 16HBE cells

圖9 各組16HBE細胞中ICAM-1 mRNA表達水平比較Figure 9 Comparison of mRNA expression level of ICAM-1 between various groups of 16HBE cells

2.3 蟬芩顆粒含藥血清對LPS誘導16HBE細胞信號通路iNOS、sGC、PKG蛋白表達的影響Western Blot 檢測結(jié)果顯示，LPS 處理后16HBE 中iNOS、sGC、PKG 蛋白水平顯著上調(diào)（P＜0.01），而高劑量蟬芩顆粒及L-NAME有效抑制了LPS誘導16HBE細胞中iNOS、sGC、PKG 蛋白表達水平的升高（P＜0.01），中、低劑量蟬芩顆粒的效果不明顯（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖10。

圖10 各組16HBE細胞中iNOS、sGC、PKG蛋白表達比較Figure 10 Comparison of he protein expression of iNOS，SGC and PKG between various groups of 16HBE cells

2. 4蟬芩顆粒含藥血清對LPS誘導16HBE細胞[Ca2+]i的影響熒光分光光度法測細胞[Ca2+]i，結(jié)果顯示，LPS 處理16HBE 細胞，導致LPS 誘導16HBE 細胞中[Ca2+]i 水平顯著上調(diào)（P＜0.01），而高劑量蟬芩顆粒及L-NAME 有效抑制了LPS 誘導16HBE細胞中[Ca2+]i水平的升高（P＜0.01），蟬芩顆粒中、低劑量無顯著效果（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖11。

圖11 各組16HBE細胞[Ca2+]i水平比較Figure 11 Comparison of cellular[Ca2+]i level between various groups of 16HBE cells

3 討論

蟬芩顆粒為上海市名中醫(yī)黃吉賡教授的治咳驗方，方中：蟬衣、僵蠶、射干疏散風熱，化痰解痙利咽，為君；柴胡、黃芩、竹瀝半夏清熱和解樞機，前胡、白前、杏仁、紫菀、款冬花宣肅并用祛痰鎮(zhèn)咳，為臣；桔梗、枳殼升降肺氣理氣祛痰，丹參、郁金活血理氣，為佐；甘草祛痰止咳調(diào)和諸藥，為使。黃吉賡教授認為，感染后咳嗽屬于久咳范疇，其病機為風邪戀肺，治以祛風清熱、化痰止咳、理氣活血為主。蟬芩顆粒應用于感染后咳嗽患者的治療，療效顯著，可有效改善感染后咳嗽患者的癥狀，提高生活質(zhì)量，減輕氣道神經(jīng)源性炎癥[6]。前期實驗研究表明，蟬芩顆粒可減輕感染后咳嗽大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥，其機制可能與下調(diào)TRPV1表達、減少速激肽SP的釋放有關[7]。鑒于蟬芩顆粒治療感染后咳嗽的療效在臨床與實驗研究中均得到驗證，本課題組基于網(wǎng)絡藥理學，運用TCMSP、PharmGKb、TTD、DrugBank 等數(shù)據(jù)庫對蟬芩顆粒藥物活性成分及靶點分析發(fā)現(xiàn)：蟬芩顆粒重要的活性成分有槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷留醇等，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛等作用，治療的主要靶點集中在iNOS、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARsγ）等，靶點對應的疾病種類集中在呼吸道疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[8]。

感染后咳嗽的反射主要受2種不同類別的感覺傳入神經(jīng)纖維控制，分別為有髓鞘Aδ纖維和無髓鞘C 纖維[13]。由感覺神經(jīng)末梢釋放以SP 為主的速激肽所介導的炎癥反應稱為神經(jīng)源性炎癥[14]。SP由TAC1基因編碼而成，主要表達于神經(jīng)元胞體及神經(jīng)纖維，其mRNA 及蛋白在不同種屬生物的支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞等亦有分布[15-18]。SP被激活后可促進IL-6、IL-1β、ICAM-1 等炎癥介質(zhì)釋放，激發(fā)炎癥反應[19]。支氣管上皮細胞是感染后咳嗽病理環(huán)節(jié)中參與神經(jīng)源性炎癥的重要效應細胞之一，病毒感染等因素可促進胞內(nèi)SP 的表達，與氣道炎癥和氣道高反應性有關[17，20]。高表達的SP 使氣道上皮細胞受到持續(xù)損害，并可間接刺激咳嗽感受器，導致咳嗽反射敏感性增加，使咳嗽發(fā)作或加重[21]。

NO 作為一種具有極強生物活性的效應分子，可由3 種一氧化氮合酶（eNOS、nNOS、iNOS）催化L-精氨酸產(chǎn)生，其中iNOS 在呼吸道疾病的病理狀態(tài)中廣泛表達，參與炎癥性疾病反應過程，與炎癥關系更為密切，是造成局部組織損傷的因素之一[22]。

TRPV1 是配體門控非選擇性陽離子通道，廣泛分布于哺乳動物的感覺神經(jīng)纖維上，尤其是無髓鞘的C 類和部分少髓鞘的Aδ 類纖維[23]，在呼吸道平滑肌細胞、上皮細胞等細胞上亦有分布[24]。TRPV1能被NO等多種炎癥介質(zhì)激活[21]，sGC是NO的重要受體，它通過β亞基的卟啉基團結(jié)合NO 分子，自身結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而被激活，活化的sGC催化cGMP，通過結(jié)合PKG 的2 個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中cGMP結(jié)合位點，激活PKG啟動下游信號級聯(lián)[25-26]，活化后的PKG 可激活TRPV1[27]，增敏后的TRPV1 通道開放，Ca2+內(nèi)流引起細胞膜去極化，啟動一系列級聯(lián)反應，介導SP 等速激肽釋放，形成神經(jīng)源性炎癥[28]。在感染后咳嗽等疾病中，TRPV1既可以作為感受器，將刺激信息整合后上傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，又可以作為效應器，接受中樞信號，激活后釋放速激肽等炎癥因子引起炎癥反應[29]。

本研究采用LPS模擬革蘭氏陰性菌感染的方法誘導支氣管上皮細胞神經(jīng)源性炎癥模型[30-32]，結(jié)果顯示，LPS 誘導后細胞中IL-6、IL-1β 等炎癥介質(zhì)明顯增高，速激肽SP 也有所升高，提示神經(jīng)源性炎癥細胞模型復制成功。在高劑量蟬芩顆粒含藥血清干預后，炎癥細胞模型因子IL-6、IL-1β、ICAM-1 及速激肽SP mRNA 水平下降，信號分子iNOS、sGC、PKG與TRPV1 mRNA（或蛋白）表達水平也同步下降，且標志TRPV1通道活化的Ca2+內(nèi)流減少，與iNOS抑制劑L-NAME作用趨勢相似。故推測蟬芩顆粒抑制支氣管上皮細胞神經(jīng)源性炎癥的作用可能是通過下調(diào)iNOS/NO-cGMP-PKG 信號通路，抑制TRPV1 通道活化而實現(xiàn)。本研究為進一步深入探索蟬芩顆粒抗氣道神經(jīng)源性炎癥的靶點，闡明該方治療感染后咳嗽的機制提供了科學的依據(jù)和基礎。