基于網絡藥理學及分子對接技術探討白芍治療早發(fā)性卵巢功能不全的作用機制

陸巖， 黃旭春， 曹曉靜， 王小云

（1.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510120）

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）又稱為卵巢早衰，是指女性在40 歲之前卵巢活動衰退的臨床綜合征，以月經紊亂（如停經或稀發(fā)月經）伴有高促性腺激素和低雌激素為特征。有調查表明，我國女性的POI發(fā)病率為2.8%，呈現(xiàn)逐年升高趨勢，并有向低齡化發(fā)展的勢態(tài)[1-3]。西醫(yī)治療以激素替代療法（HRT）為主，可改善低雌激素癥狀、預防遠期并發(fā)癥。盡管HRT 臨床療效肯定，但有研究指出長期使用HRT 將增加乳腺癌、中風和心血管疾病等的發(fā)病風險[4]。中醫(yī)藥在改善月經異常及女性生殖能力方面取得了良好療效，且安全、副作用少[5]。其中，白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，有養(yǎng)血調經、斂陰止痛、平抑肝陽之功效，主治血虛萎黃、月經不調等病證[6]。醫(yī)家張錫純《醫(yī)學衷中參西錄》中累計使用藥物頻次，白芍居于首位[7]。POI 用藥規(guī)律的研究結果顯示，白芍為常用高頻藥物[8-9]。網絡藥理學是一門在系統(tǒng)層面揭示中藥對機體調控網絡作用的學科，內容涉及多向藥理學、系統(tǒng)生物學、網絡分析等多個學科領域，通過網絡在線數(shù)據(jù)庫檢索、計算機軟件等構建“化合物-基因-疾病”相互作用網絡圖，系統(tǒng)詮釋藥物與疾病間的關聯(lián)性，為研究傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥理學之間的相互關系搭建了橋梁[10-11]。其整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點與中醫(yī)藥學的基本特點相吻合。為臨床應用白芍治療POI提供證據(jù)，本研究基于網絡藥理學及分子對接技術進一步探討白芍多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用治療POI的機制，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1. 1白芍活性成分的篩選以“白芍”為關鍵詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索，獲取白芍的主要活性成分。因中藥多為口服制劑，故以藥代動力學參數(shù)（ADME）為依據(jù)，設置藥物口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似度（DL）≥0.18，篩選出活性成分。結合文獻研究[12-14]挖掘，最終確定白芍的主要活性成分。

1.2 白芍活性成分作用靶標的篩選應用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的“靶點預測”功能，預測白芍活性成分的作用靶標。再利用perl 軟件（http://www.perl.org/）對收集的化學成分及作用靶標添加基因名。

1.3 POI疾病靶標的獲取與收集GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）是一個分析人類基因數(shù)據(jù)的綜合數(shù)據(jù)庫；在線“人類孟德爾遺傳”數(shù)據(jù)庫（OMIM，Online Mendelian Inheritance in Man，https://omim.org/）記錄了所有已知疾病的遺傳成分，并可以預測它們與人類基因組中相關基因的關系。將“Premature Ovarian Insufficiency”輸入GeneCards 與OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索獲取與POI 相關的靶標，并去除重復部分。然后運用R軟件（https://www.rproject.org/）將與白芍有效成分相關的靶標和疾病靶標取交集，獲得白芍活性成分治療POI的靶標，并繪制韋恩（Venn）圖。

1.4 藥物-成分-靶標-疾病網絡的構建將白芍活性成分所對應的靶標和POI 相關的靶標取交集，獲得的靶標即為白芍治療POI 的關鍵靶標。使用Cytoscape 3.7.2 軟件（http://www.cytoscape.org）構建“藥物-成分-靶標-疾病”關系網絡。網絡中的“節(jié)點”代表白芍藥物、有效成分與關鍵靶標；“邊”代表藥物-成分、成分-靶標、靶標-疾病之間的連接。整個網絡展示了藥物-成分-靶標-疾病之間的聯(lián)系，通過這一網絡可以深入分析白芍治療POI 的作用機制。以網絡節(jié)點度（degree）值和中介中心度（betweenness centrality）為篩選條件，挖掘網絡核心節(jié)點。

1. 5靶標蛋白相互作用（PPI）的網絡構建使用STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）預測蛋白質之間的相互作用。選擇“Multiple Proteins”功能，選擇“物種”為人類（Homo Sapiens），將白芍治療POI 的關鍵靶標導入數(shù)據(jù)庫進行檢索，即可構建PPI 網絡。STRING 數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)還可以對預測結果進行評分，分值越高，表示PPI 結果的置信度越高。本研究設定評分分值＞0.40，獲得節(jié)點度值等反映靶點之間相互關系的信息。

1.6 關鍵靶標的生物功能注釋與通路分析先用perl軟件將白芍治療POI的關鍵靶點名稱轉換成entrez ID，然后進入Bioconductor（http://www.bioconductor.org/）找到R 軟件。Bioconductor 是目前最常用的高通量基因組數(shù)據(jù)分析工具之一，它以R 軟件為平臺提供了19個物種（含人類）的基因本體論（GO）注釋信息。ClusterProfiler是基因數(shù)據(jù)分析的R語言工具之一，結合entrez ID，得到GO 注釋信息和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集信息。運用上述工具，以P＜0.05為條件，進行信號通路富集分析及結果可視化。

1.7 分子對接根據(jù)網絡構建的拓撲結果，用分子對接模擬研究配體在復雜分子網絡中的潛在相互作用。從RCSB數(shù)據(jù)平臺（PDB，www.rcsb.org）檢索PPI 網絡中核心靶標的3D 結構PDB 格式文件。再從ZINC 數(shù)據(jù)庫（http://zinc.docking.org）下載網絡圖中度值居前列的藥效分子的Mol2 格式文件。采用Autodock 進行核心成分與核心靶標間的分子對接驗證。利用結合能來評估分子與靶點的結合能力，結合能＜0 表明能自發(fā)結合，結合能≤-5 kcal/mol表明結合良好。

2 結果

2.1 白芍活性化合物的篩選分析通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到白芍有效成分85 個，以OB ≥30%和DL ≥0.18為條件進一步篩選出13個有效成分，主要成分為芍藥苷、芍藥苷元酮、樺木酸、β-谷甾醇、谷甾醇、山柰酚、兒茶素、苯甲酰芍藥苷等，結果見表1。

表1 白芍主要活性成分及其口服生物利用度（OB）和藥物相似度（DL）值Table 1 Active components of Radix Paeoniae Alba and their OB and DL values

2.2 白芍成分治療POI的潛在作用靶點預測通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫預測白芍的主要活性成分作用靶標，除重后共獲得62 個靶標。Gene Cards 數(shù)據(jù)庫收集疾病靶標2 718 個，OMIM 數(shù)據(jù)庫收集疾病靶標166個，整合數(shù)據(jù)庫檢索結果并去除重復基因后共獲取POI 相關基因靶標2 809 個。運行R 語言“VennDiagram”程序包將白芍有效成分相關的靶標與POI相關靶標取交集，獲得白芍活性成分治療POI的靶標，并繪制韋恩（Venn）圖。結果顯示白芍對POI 可能起到作用的靶標共35 個，表明白芍是通過多個靶點發(fā)揮治療POI作用的。

2. 3白芍-成分-靶標-POI網絡構建應用Cytoscape 3.7.2 軟件構建“藥物-有效成分-靶標-疾病”相互作用的網絡圖，見圖1。該網絡由44個節(jié)點組成，包括7 個成分節(jié)點、35 個靶標基因節(jié)點、1 個藥物節(jié)點及1 個疾病節(jié)點。綠色代表疾病，紅色代表藥物，黃色節(jié)點代表白芍的主要有效成分，藍色節(jié)點代表作用靶標。

圖1 白芍治療POI的藥物-成分-靶標-疾病網絡Figure 1 Drug-component-target-disease network of Radix Paeoniae Alba for treatment of POI

網絡節(jié)點度值和接近中心度反映了網絡中節(jié)點核心度的高低，度值越高，表明該節(jié)點越重要。將度值和中介中心度值按大小排序篩選核心成分和靶點，結果顯示，kaempferol（山柰酚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、（+）-catechin（兒茶素）等白芍有效成分以及PGR（孕激素受體）、PTGS1（前列腺素G/H 合酶和環(huán)氧合酶）、NR3C2（鹽皮質激素受體基因）等作用靶標是網絡的核心節(jié)點，提示這些節(jié)點是白芍治療POI 的關鍵有效成分或靶標。具體結果見表2。

表2 白芍-成分-靶標-POI網絡關鍵節(jié)點Table 2 Key nodes in Radix Paeoniae Albacomponent-target-POI network

2. 4白芍治療POI的關鍵靶標PPI網絡分析結果進入STRING數(shù)據(jù)庫，上傳白芍活性成分治療POI 的靶標，將置信度評分設定為分值＞0.40，去除游離于網絡之外的蛋白，得到白芍活性成分對應的靶標PPI 網絡，見圖2。該網絡共包含節(jié)點35 個，邊153 條，平均度值為8.74。邊數(shù)越多表示該節(jié)點對應的靶標在網絡中的作用越重要。運用R 語言抽取網絡中的關鍵靶標的信息條形圖，見圖3。IL-6（白細胞介素6）、CASP3（半胱氨酸蛋白酶3）、MAPK8（絲裂原激活蛋白激酶8）、RELA（核轉錄因子Rel A）、ESR1（雌激素受體1）是關聯(lián)度值最大的前5個節(jié)點，這5個節(jié)點可能是白芍治療POI 的重要靶標。其中IL-6 關聯(lián)度最大，有研究表明，卵泡液內有較高水平的IL-6，其與雌二醇（E2）產生及卵母細胞成熟度有一定關系[15]。

圖2 白芍治療早發(fā)性卵巢功能不全（POI）關鍵靶標的PPI網絡Figure 2 PPI of core target genes of Radix Paeoniae Alba for treatment of POI

圖3 白芍治療早發(fā)性卵巢功能不全（POI）的PPI核心靶標基因Figure 3 Core target genes in PPI of Radix Paeoniae Alba for treatment of POI

2.5 關鍵靶標生物功能及通路分析將白芍可能對POI發(fā)揮作用的靶標導入軟件R×64 3.6.2，進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析。GO功能富集共獲得59 條目，根據(jù)P值大小進行排序，選取前20 個條目展示，見圖4。結果顯示白芍治療POI 的關鍵靶標主要富集在核受體活性（nuclear receptor activity）、轉錄因子活性（transcription factor activity），直接配體調控特異性DNA 結合（direct ligand regulated sequence-specific DNA binding），類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）等。

圖4 白芍治療早發(fā)性卵巢功能不全（POI）靶標的GO功能富集Figure 4 GO enrichment in POI targets treated by Radix Paeoniae Alba

KEGG 通路富集結果共得到85 條通路，24 條信號通路，主要包含免疫炎癥相關通路、細胞信號轉導途徑、代謝相關通路、癌癥相關通路、細胞發(fā)展過程相關通路、傳染病相關通路等，見圖5。KEGG 通路富集分析結果顯示，晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體信號通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）是最為顯著的信號通路，可能是白芍治療POI 重要的信號通路。其他起作用的信號通路還包括IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）等。表明白芍的有效成分是通過調控多種生物學途徑發(fā)揮治療POI作用的。

圖5 白芍治療POI關鍵靶標KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway Enrichment analysis of key targets in POI treated by Radix Paeoniae Alba

2.6 分子對接選擇網絡核心成分山柰酚與PGR進行分子對接。通過Pymol 軟件進行可視化，從圖6-A1～A2可以清楚地看出，山柰酚與PGR 不會形成氫鍵。山柰酚與PGR 的結合能為-6.41。在圖6-B1～B2中，山柰酚與PTGS1 的分子對接結果表明，山柰酚與ATP 競爭PTGS1 的結合位點，并通過與相應骨架的氨基和羰基形成氫鍵而緊密結合殘基（Asn-382，His-388，Ala-199）。山柰酚與PTGS1 的結合能為-7.64。在圖6-C1～C2中，山柰酚與NR3C2 的分子對接結果表明，兩者通過與相應殘基的主鏈氨基和羰基形成氫鍵而與NR3C2 緊密 結 合（Leu-938，Ser-810， ARG-817，Asn-770）。山柰酚與NR3C2 的結合能為-7.46。這些結果證明，山柰酚和PTGS1、NR3C2對接結果良好。

圖6 山柰酚與PGR、PTGS1、NR3C2的分子對接結果Figure 6 Molecular docking results of kaempferol and PGR，PTGS1 and NR3C2

3 討論

中醫(yī)古代文獻中沒有早發(fā)性卵巢功能不全（POI）的病名，根據(jù)其主要臨床癥狀，可歸屬于“血枯”“經閉”“月經過少”“經水早斷”等范疇。POI患者多為先天不足，加之后天失養(yǎng)，久病損耗或金刃損傷等引起精血耗竭，沖任虧損，機體常年處于“陰血不足”的狀態(tài)，故肝體失養(yǎng)而疏泄失常，肝氣郁結。然而“女子以血為用”，陰陽失衡，氣血不調，往往最先出現(xiàn)卵巢功能減退。白芍具有養(yǎng)血調經、斂陰柔肝的功效。既往藥理研究顯示，白芍具有抗炎、免疫調節(jié)、鎮(zhèn)靜、抗抑郁、抗驚厥、解熱、解痙、護肝、擴張血管、耐缺氧等作用[16-17]。有研究報道，白芍及其配伍能調整血清雌二醇（E2）、孕酮（P）、催乳素（PRL）、促卵泡生成激素（FSH）的紊亂[18]，以白芍為君藥的養(yǎng)陰舒肝顆粒可以緩解模型小鼠的肝郁狀態(tài)[19]，可以改善卵巢的功能[20]。

本研究運用TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出13 個白芍潛在有效成分，根據(jù)拓撲出的關鍵節(jié)點，山柰酚、β-谷甾醇及兒茶素是白芍作用于POI的主要3個成分。其中：β-谷甾醇為萜類，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[21]；山柰酚為黃酮類，具有抗炎、抗氧化、護肝等作用[22]；兒茶素為酚類，具有抗炎、抗癌等作用[23]。高靜[24]發(fā)現(xiàn)POI 患者外周血輔助性T1 細胞比例明顯增加，宗國霞等[25]也發(fā)現(xiàn)POI患者外周血T淋巴細胞亞群CD3+顯著升高；而慕靜靜等[26]研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚能顯著抑制小鼠T淋巴細胞體外活化和增殖。曾莉萍等[27]發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇能明顯促進卵巢顆粒細胞分泌E2，而POI患者臨床表現(xiàn)為雌激素水平波動性下降。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞減少或成熟障礙會降低卵巢的儲備功能，加快卵巢早衰的發(fā)展[28]，而表兒茶素是兒茶素的一種，可提高小鼠卵母細胞的數(shù)量及其發(fā)育潛能[29]。故本研究預測白芍通過山柰酚、β-谷甾醇、兒茶素等有效成分改善POI。

從拓撲出的關鍵節(jié)點來看，PGR、PTGS1、NR3C2 等既是POI 靶標又是白芍活性成分預測靶標。PGR 屬于甾體激素核受體家族，可結合孕激素發(fā)揮生理功能，在動物的發(fā)育、生殖中起著十分重要的作用[30]；且有研究表明PGR 調節(jié)因子在卵巢組織內相互協(xié)調作用以指導排卵[31]。PTGS1編碼的蛋白是前列腺素H2轉化為前列腺素D2的關鍵酶[32]，這種酶廣泛分布于子宮、卵巢、輸卵管等部位，參與生殖系統(tǒng)的調控[33]。NR3C2產物鹽皮質激素受體主要參與緊張焦慮情緒調控，最新研究提示鹽皮質激素可能在牛卵巢中發(fā)揮內分泌、旁分泌、自分泌的作用[34]。

KEGG 通路富集分析結果表明，AGE-RAGE信號通路、TNF 信號通路、IL-17信號通路等是白芍治療POI 的重要信號通路。梁嘉麗[35]研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細胞自噬參與了POI的發(fā)病過程。包繼明[36]發(fā)現(xiàn)，AGE-RAGE 可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路，而PI3K/Akt 信號通路是參與顆粒細胞自噬的信號通路[37]。李寧[38]研究白藜蘆醇對POI大鼠的治療效果也發(fā)現(xiàn)，通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路可以抑制顆粒細胞凋亡來達到治療POI的目的。TNF信號通路是炎性反應的重要通路，TNF-α 是重要的炎性因子，能誘導中性粒細胞的浸潤，引起炎癥反應。近年來的研究表明，炎癥性衰老在POI的發(fā)病機理中起著重要作用[39]。俞曉敏等[40]研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮可減輕腹腔注射脂多糖誘導大鼠慢性低度炎癥反應以改善卵巢功能。此外，TNF-α 蛋白表達增加能明顯促進卵巢生殖干細胞的增殖[41]，而卵巢干細胞巢的衰老和退化被認為是導致卵巢生殖功能衰退的主要因素[42-43]。IL-17F 是IL-17 家族的一種原型細胞因子，它可以誘導不同的組織和細胞產生炎性細胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶。研究表明，IL-17F 參與潰瘍性結腸炎的免疫調節(jié)[44]，IL-17在固有免疫水平和適應性免疫水平均具有重要的抗感染作用[45]。

綜上所述，白芍可能通過有效成分山柰酚、β-谷甾醇、兒茶素介導AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路、IL-17 信號通路等發(fā)揮抗炎性反應、調節(jié)免疫、增加卵母細胞數(shù)量及抑制顆粒細胞凋亡等藥理作用來治療POI。本研究針對白芍單味中藥僅展開預測研究存在一定局限性，后續(xù)將進一步體內體外驗證白芍治療POI多成分、多靶點的機制特點。