雞胸腺組織中免疫相關circRNA鑒定

劉 銳，李江凌，杜華銳,3，楊朝武,3，陳家磊，趙素君，王秋實

(1.四川省畜牧科學研究院，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066；3.四川大恒家禽育種有限公司，成都 610066)

烏骨雞作為食藥同源珍禽廣受消費者喜愛。四川獨有的烏雞品種——山地烏骨雞具有“十全烏”特征[1]，且體型較大，其料重比、增重能力和屠宰性能均明顯優于絲羽烏骨雞[2]，具有較強的開發利用價值，但抗逆性差[3]、成活率較低[4]的缺點嚴重制約了山地烏骨雞的推廣應用。開展雞抗病力研究不僅對優質雞資源的推廣十分重要，而且是當前家禽業集約化生產亟待解決的難題。對病原體的抵抗涉及免疫系統各個分支的動態合作，這使得識別抗病基因成為艱巨的任務，而開發環狀RNA(circular RNA,circRNA)新功能為抗病力研究提供了新的解決方案。

circRNA是隨著高通量測序技術發展而被重新認識的一類環狀RNA分子，由于其表達的特異性和調控的復雜性，其在疾病發生中的重要作用越來越受到重視[5-6]。據報道，circRNA可從多個水平上調控基因表達，在許多生理和病理條件下是必不可少的[7]。Chen等[8]研究發現，外源circRNA能有效刺激天然免疫相關基因的表達，從而防止病毒感染。Li等[9]研究顯示，細胞感染病毒后內源性circRNA表達減少，主要是由于circRNA和免疫因子形成circRNA-蛋白復合物(circRNA-protein complexes,circRNPs)來協調抗病毒免疫反應。circRNA在免疫系統中發揮著重要作用，但在家禽上相關報道較少。2020年，Liu等[10]在2和20 d雞胚法氏囊中識別到13 689個circRNAs分子，其中27個circRNAs在兩個不同發育階段差異表達，表明circRNA在法氏囊中有豐富的表達，推測其對法氏囊的發育是必不可少的。

胸腺是雞胚胎期最早發生的免疫器官，是T細胞發生、分化和成熟的場所[11]，在功能性免疫中發揮著至關重要的作用，因此，胸腺是基礎免疫研究的良好模型。本研究以抗病力不同的黃羽肉雞(大恒肉雞)和山地烏骨雞胸腺組織為試驗材料，通過轉錄組測序篩選免疫相關的circRNA分子，探討其在雞免疫調節中可能的作用機制，以期為提高雞抗病力研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于四川大恒家禽育種有限公司育種場隨機選擇相同環境下以相同條件飼養至10周齡的健康黃羽肉雞(大恒優質肉雞)和山地烏骨雞公雞各5只，屠宰后取胸腺組織并立即液氮凍存備用。共計獲得10個雞胸腺組織樣品，黃羽肉雞胸腺組織命名為RT,山地烏骨雞胸腺組織命名為WT。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒(Perfect Real-time)購自TaKaRa公司；SYBR Green qPCR Mix(ROX)購自Roche公司。Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time購自ThermoFisher Scientific公司；NanoDrop ND-1000購自NanoDrop Technologies公司；Agilent2100購自Agilent Techno-logies公司；IlluminaHiseq購自Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取 用Trizol法提取總RNA，按照試劑盒操作說明進行。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染，用NanoDrop ND-1000測定總RNA的純度和濃度，用Agilent 2100精確檢測RNA完整性。

1.3.2 測序和數據質檢 采用去除核糖體RNA的方法構建特異性文庫，在Illumina PE150平臺進行RNA-Seq測序。使用軟件Hisat2將有效測序數據(clean reads)比對到基因組(Gallusgallus_Ensembl_97)，經比對和拼接后得到用于后續分析的轉錄本數據。

1.3.3 circRNA鑒定 用circRNA鑒定軟件find_circ和CIRI對轉錄本數據進行circRNA識別，求取2個軟件結果交集，參考基因組比對結果對其序列結構和分布進行統計分析，解析雞胸腺circRNA基本特性。

1.3.4 circRNA表達差異及功能富集分析 用readcount統計circRNA的表達水平，并進行TPM(Transcripts Per kilobase Million)標準化處理。用DESeq2進行表達水平差異顯著性分析，對差異顯著circRNA的來源基因進行GO功能和KEGG通路富集分析以完成差異circRNA的功能注釋，從而篩選出與免疫相關的circRNA。

1.3.5 circRNA編碼潛能預測 利用IRESfinder軟件識別circRNA序列的內部核糖體進入位點(IRES)，分值>0.5具有IRES元件，分值越高，準確度越高。利用PFAM軟件識別circRNA序列的蛋白結構域，綜合2個軟件分析結果判定circRNA是否具有編碼潛能。

1.3.6 實時熒光定量PCR 利用Primer Express設計引物，注意反向引物設計應當先將circRNA序列3′-端約150 bp截取置于5′-端，將設計的引物與NCBI Primer-blast上的序列進行比對，確保特異性，引物信息見表1。利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，在Applied Biosystems 7500 Fast Real-time上用SYBR Green qPCR Mix對部分circRNA進行實時熒光定量PCR，用于驗證測序獲得的基因表達水平。每個樣品設3個重復。PCR反應體系15 μL：SYBR Green qPCR Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 6.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，61 ℃ 退火延伸1 min，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.4 統計分析

用基于負二項分布的DESeq2進行樣品表達差異顯著性分析，顯著性檢驗的參數閾值設置為：log2|FoldChange|>1，P<0.05，即篩選表達量2倍以上的差異circRNA。

2 結 果

2.1 測序數據統計結果

由表2可知，10個胸腺組織circRNA測序共獲得0.9×109條clean reads，各樣本分別有92.63%～94.64% reads可比對到參考基因組，共約為0.85 G(93.70%)reads，平均每個樣本reads數為84.99 M，說明測序數據經過過濾、測序錯誤率檢查等可滿足后續分析。

2.2 circRNA鑒定

用生物信息學軟件find_circ和CIRI共識別到8 015個circRNAs。與參考基因組的比對注釋發現，circRNA在雞染色體上分布廣泛但不均勻，在前10對大型染色體上數量相對較多，而微小染色體上數量則較少，性染色體Z上共鑒定到369個circRNAs，甚至超出部分常染色體(表3)，說明circRNAs的數目和染色體的長度有一定的相關性。

統計顯示,雞胸腺circRNA的長度在300 bp左右(中位數297)，最長的超過800 bp，circRNA的長度呈現正態分布(圖1)。序列結構顯示circRNA主要由外顯子組成(圖2)。

根據與參考基因組的比對結果，有550個(6.9%) circRNAs沒有發現相應的來源基因，其他的circRNAs定位到基因組上2 663個基因中，其中大部分基因(1 357個，50.96%)產生1個circRNA；其他多數基因則產生2～4個circRNAs(圖3)，說明只有1個亞型的circRNA在胸腺組織中占優勢。

圖1 circRNA長度分布
Fig.1 Length of circRNA

圖2 circRNA結構組成Fig.2 Structure component of circRNA

圖3 circRNAs來源基因分布Fig.3 Distribution of circRNAs among genes

2.3 circRNA表達差異分析

采用DEseq2進行circRNA表達差異分析，結果顯示，在2個品種間差異表達(differential expression，DE)的circRNAs有115個(1.43%，115/8015)，其中54個在黃羽肉雞中表達上調，61個表達下調(以山地烏骨雞為對照，圖4)。兩品種間差異比較P值最小的是circ_0002478，其次是circ_0004186，分別是黃羽肉雞中上調和下調表達的差異水平最顯著的2個位點。這2個circRNAs來源于白介素受體1(IL-1R1)和N-myc下游調控基因3(NDRG3)，前者是細胞因子引起的免疫和炎癥反應的重要介質；后者編碼的蛋白與細胞凋亡、自噬及信號轉導相關，在許多腫瘤細胞中可以促進腫瘤細胞的生存和發展，均參與免疫系統調節。

圖4 兩雞種間差異表達circRNAs火山圖Fig.4 Volcano plot of differentially expressed circRNAs between two breeds

2.4 差異表達circRNA功能分析

利用GOseq軟件對DE circRNA來源基因進行了GO功能富集分析，共得到104個免疫相關GO條目，前10個見圖5，所有免疫相關GO條目都是屬于生物過程(biological process)類型，主要涉及細胞因子調控(positive regulation of response to cytokine stimulus,regulation of response to cytokine stimulus)、免疫細胞分化(T-helper 1 cell differentiation,CD4-positive,alpha-beta T cell differentiation)、激活(CD4-positive,alpha-beta T cell activation)以及免疫信號通路調控(regulation of cytokine-mediated signaling pathway,positive regulation of cytokine-mediated signaling pathway)。

104個免疫相關GO條目中富集了21個來源基因，很多來源基因在不同的GO條目中重復出現。21個來源基因共產生23個DE circRNAs，其中12個在黃羽肉雞中表達上調，11個表達下調(表4)。21個來源基因主要在免疫反應過程、免疫信號通路傳導、免疫調節中發揮重要作用。大部分基因只檢測到1個差異表達的circRNA，只有淋巴增強子結合因子(LEF1)和細胞質分裂付出蛋白1(DOCK1)有2個差異circRNAs，來源于LEF1基因的2個cricRNAs表達均上調，而來源于DOCK1基因的2個circRNAs表達均下調。

KEGG通路分析結果顯示，來源基因主要參與細胞因子-細胞因子受體互作、FoxO信號通路、NOD樣受體信號通路、TLR樣受體信號通路等生物學通路，其中與免疫相關的通路有7個，共富集了7個來源基因，涉及7個DE circRNAs,其中在黃羽肉雞中有3個表達上調，4個表達下調(表5)。

由表4、5可知，GO功能和KEGG通路富集分析篩選出來的與免疫相關的來源基因中有5個是相同的，分別是MAPK11、IL-1R1、STX8、RIPK2和BRAF，其中來源于STX8和BRAF的circRNA在黃羽肉雞中表達上調(circ_0001674、circ_0003590)，其余均表達下調。STX8通過囊泡融合和胞吐參與蛋白運輸；BRAF通過免疫相關信號通路影響細胞分裂、分化和分泌；MAPK11和RIPK2與細胞活動有關，MAPK11基因調節細胞增殖、分化和發育；RIPK2影響細胞凋亡；IL-1R1在細胞因子活動中提供介質，這5個基因分別參與體液免疫和細胞免疫，相應的5個circRNAs可能在雞胸腺免疫調節中發揮重要作用。

圖5 差異circRNA來源基因GO功能富集(前10)Fig.5 Go function enrichment of source genes from differentially expressed circRNA (top 10)

表4 免疫相關GO功能富集的基因及其circRNA

表5 免疫相關KEGG通路中富集的來源基因及其circRNA

2.5 編碼潛能預測

從表6可知，在GO功能和KEGG通路富集分析中共有14個circRNAs具有IRES元件，其中有編碼潛能的有7個，而這7個circRNAs中只有來源于IL-1R1基因的circ_0002478在GO功能和KEGG通路中重復出現。

表6 免疫相關circRNA編碼潛能預測

2.6 實時熒光定量PCR驗證

為了驗證測序數據的準確性，采用實時熒光定量PCR對鑒定到的circRNAs的表達水平進行檢測，結果見圖6。由圖6可知，經測序數據識別的circRNAs可用實時熒光定量PCR技術檢測，其中circ_0002478、circ_0003208和circ_0005105在黃羽肉雞中的表達量極顯著或顯著低于山地烏骨雞(P<0.01；P<0.05)；而circ_0001674和circ_0003590在黃羽肉雞中的表達量極顯著高于山地烏骨雞(P<0.01)，這5個差異表達的circRNAs在2個雞品種中差異趨勢同測序結果是一致的。

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)*，Significant difference (P<0.05)；**，Extremely significant difference (P<0.01)圖6 差異表達circRNAs實時熒光定量PCR驗證Fig.6 Real-time quantitative PCR verification of differentially-expressed circRNAs

3 討 論

目前，全球肉類消費已轉向家禽，根據FAO統計數據，2020年禽肉占全球肉類蛋白總量的39.5%，超過豬肉(32.5%)、牛肉(21.2%)和羊肉(4.8%)，位居第一。中國受消費習慣和文化的影響，豬肉一直作為肉類蛋白的主要來源，但近兩年在非洲豬瘟的影響下，雞肉消費需求增長明顯。但禽業發展面臨著諸多挑戰，如疾病風險、食品安全、動物福利等，特別是消費者關注的抗生素和藥物殘留直接影響生物安全和食品安全。培育出滿足市場需求的品種，提高動物的抗病力，完善生物安全體系，才能推動家禽產業的持續健康發展。

circRNA分子的發現更新了RNA領域的研究深度，其廣泛性、保守性、特異性和穩定性預示著它在許多生物學過程中發揮作用。近幾年研究發現，circRNA分子可參與來源基因順式調控[12]、與miRNA(microRNA,微小RNA)分子結合發揮海綿作用[13]及與蛋白結合形成功能復合物[9]，是基因表達調控中的重要因子。隨著研究的深入，circRNA功能將進一步被揭示，特別是circRNA與免疫系統的互作。Liu等[14]研究發現，circRNA通過結合雙鏈RNA依賴的蛋白質激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)調控先天性免疫，致病性雙鏈RNA激活RNA酶L(RNase L)可降解circRNA從而釋放PKR，發揮抗病毒作用，在先天性免疫缺陷的患者中circRNA數量銳減且PKR活性異常，相同序列的circRNA和線性RNA相比，circRNA與PKR的結合強度要高很多，證實circRNA在先天性免疫中的重要性。Li等[9]認為，circRNA能調節病毒感染后的免疫反應，因為細胞感染病毒后內源性circRNA數量減少。Chen等[8]用外源circRNA轉染細胞后，先天性免疫調節因子和細胞因子被強烈誘導，細胞產生明顯的免疫反應信號，且這種反應比同一序列的線性RNA轉染細胞時更強烈。以上研究表明，circRNA可影響免疫系統調節。

本研究利用RNA-Seq技術在胸腺這個雞最早發育的免疫器官中鑒定到對雞免疫力有影響的circRNA分子。黃羽肉雞(大恒肉雞)是經過多年選育的培育品種，聚合了地方雞優良基因，抗病力強，其10周齡成活率超過98%[15]，而山地烏骨雞是自然選育形成的，未經過目的明確的人工選擇，抗病力較差，其10周齡成活率低于80%[3]，二者差異明顯。RNA-Seq數據顯示，2個品種間有115個差異表達circRNAs。通過GO功能注釋篩選出免疫相關GO條目104個，共富集了21個基因，表明許多基因有相同或相似的免疫調節功能。這21個基因產生的circRNAs中有23個在2個品種間差異表達。在所有的DE cricRNA中免疫相關cricRNA占比高達20%(23/115),說明了circRNA對機體免疫體系是必不可少的。KEGG通路分析發現有7個基因在免疫相關的通路富集，這些通路包括細胞因子-細胞因子受體相互作用、FoxO信號通路，Toll樣受體信號通路、RIG-Ⅰ樣受體信號通路和囊泡轉運中SNARE蛋白互作等。免疫相關通路涉及7個DE circRNAs，其中有5個circRNAs與GO功能注釋中DE circRNA相同，分別是circ_0002478(IL-1R1)、circ_0003208(MAPK11)、circ_0001674(STX8)、circ_0005105(RIPK2)及circ_0003590(BRAF)，推測它們可能在免疫系統調節中扮演著重要角色。

值得注意的是，在25個免疫相關circRNAs中circ_0002478(IL-1R1)在兩品種間差異極顯著，可能通過細胞因子-細胞因子受體通路參與免疫和炎癥反應。在Guo等[16]構建的雞應激誘導免疫抑制模型中細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路被高度激活，說明該通路對于免疫反應調節十分重要。Neyt等[17]研究發現，缺乏IL-1R1的小鼠病毒清除延遲，病毒復制時間延長，導致疾病嚴重程度增加。因此，circ_0002478(IL-1R1)的存在對于應對病毒或炎癥反應可能是必需的。

circRNA早期被認為是異常剪接產物，多年后在人和動植物組織中發現數百個circRNAs時，其生物學功能才被重視。circRNA作為miRNA海綿或與來源基因mRNA競爭參與基因表達調控已被證明，但關于circRNA翻譯成蛋白并發揮生物學功能的機制引起了熱烈的討論[18-20]。Wesselhoeft等[21]用生物工程技術合成外源性circRNA并使其在細胞中穩定表達蛋白；Costello等[22]使用結構化內含子表達載體在活的哺乳動物細胞中從質粒DNA(pDNA)中穩定地產生circRNA,并通過滾環翻譯產生大量分泌蛋白。Zhang等[23]鑒定了1個由circRNA編碼的87個氨基酸的肽PINT87aa，在功能上，PINT87aa而非其相應的circRNA部分控制癌細胞的細胞增殖和腫瘤發生。以上研究表明，circRNA能夠編碼蛋白，且在其翻譯的肽的生物學意義和對疾病生理的影響方面潛力巨大。本研究對篩選出的與免疫相關的circRNA進行了編碼潛能預測，有7個circRNAs具有IRES位點和蛋白域，其中circ_0002478(IL-1R1)在功能注釋和通路分析中重復出現，說明circ_0002478(IL-1R1)在免疫調節中發揮重要作用，且可能以多種方式發揮功能，如與IL-1R1競爭從而調節免疫反應，或者翻譯成多肽調節炎癥反應，具體作用機制尚需進一步研究。

4 結 論

本研究采用高通量測序揭示了雞胸腺組織circRNA表達特征，差異分析結果顯示雞胸腺組織有豐富的circRNA，且circRNA對機體免疫調節是必不可少的，在篩選出的5個與免疫相關的circRNAs(circ_0002478(IL-1R1)、circ_0003208(MAPK11)、circ_0001674(STX8)、circ_0005105(RIPK2)和circ_0003590(BRAF))中，circ_0002478(IL-1R1)可能通過多種方式參與免疫調節，可作為雞免疫力研究的重點關注靶點。