水體中甲基炔諾酮對(duì)斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育的毒性作用

鄧希楷，何雨桐，馮婷茵，孫蘇里

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

甲基炔諾酮（Norgestrel，NGT）是一種合成的類(lèi)固醇孕酮，與乙炔雌二醇聯(lián)合用于口服避孕。諾孕酮是由右旋諾孕酮和左旋諾孕酮這2 種立體異構(gòu)體組成的外消旋混合物。然而，只有左旋對(duì)映體（左炔諾孕酮）具有生物活性。作為避孕藥中的活性成分，左炔諾孕酮對(duì)三棘刺魚(yú)（Gasterosteus aeuleatus）有強(qiáng)烈的雄激素效應(yīng)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其對(duì)雌性黑頭呆魚(yú)（Pimephales promelas）有雄性化作用[1-2]。此外，在畜牧業(yè)中，甲基炔諾酮也經(jīng)常用于控制牲畜的繁殖。由于甲基炔諾酮的廣泛應(yīng)用，加上污水處理廠過(guò)濾不徹底，導(dǎo)致不同水體中存在一定濃度的甲基炔諾酮。例如，曾在地表水體和污水處理廠廢水中檢測(cè)到22 和11 ng/L 的甲基炔諾酮。在畜牧產(chǎn)業(yè)排放的廢水中，廣西某豬場(chǎng)和某奶牛廠就曾檢測(cè)到濃度高達(dá)6 460～10 800 ng/L 的甲基炔諾酮[3-6]。這些大量存在于水體環(huán)境中的甲基炔諾酮會(huì)嚴(yán)重影響斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育。

斑馬魚(yú)是一種生活在熱帶的小型淡水魚(yú)，具有適應(yīng)性強(qiáng)、對(duì)水質(zhì)要求低、在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下易于飼養(yǎng)、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎易收集等特點(diǎn)，是環(huán)境毒理學(xué)試驗(yàn)的理想模型[7]。此外，斑馬魚(yú)的遺傳背景明確，與人類(lèi)的基因組具有高度同源性[8-9]。因此，筆者以斑馬魚(yú)作為研究模型，通過(guò)比較不同濃度NGT暴露下斑馬魚(yú)胚胎的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平，尋找NGT 影響下表達(dá)發(fā)生明顯差異的基因，從而揭示水體環(huán)境中不同濃度NGT 對(duì)斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將斑馬魚(yú)在實(shí)驗(yàn)室條件下穩(wěn)定飼養(yǎng)3 個(gè)月（控制飼養(yǎng)水體環(huán)境的硬度、pH 值、溶解氧含量、溫度、光周期等參數(shù)）。穩(wěn)定后挑選成熟健康的斑馬魚(yú)進(jìn)行交配，控制溫度26℃，光暗比為12 h ∶12 h，挑選新產(chǎn)出的健康斑馬魚(yú)胚胎用于暴露試驗(yàn)。

主要試驗(yàn)試劑有甲基炔諾酮（純度99%）、二甲亞砜（DSMO，純度99%）、RNA keeper、TRIzol 試劑、曝氣24 h 自來(lái)水等，試驗(yàn)所用試劑均為分析純。主要試驗(yàn)儀器有燒杯、移液槍、塑料吸管、Illumina Hiseq 2000 測(cè)序儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NGT 暴露試驗(yàn) 將挑選好的斑馬魚(yú)胚胎分別暴露在含有0、5、50 ng/L NGT 的水體環(huán)境中，暴露時(shí)間為96 h，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)平行組。在暴露試驗(yàn)過(guò)程中，每12 h 更新一次暴露環(huán)境，以保持整個(gè)暴露過(guò)程中條件保持穩(wěn)定，空白對(duì)照組使用曝氣24 h 的自來(lái)水。毒性測(cè)試要求試驗(yàn)過(guò)程中水的pH 值變動(dòng)范圍在±0.2，溫度變化范圍在±1℃，試驗(yàn)結(jié)束后溶解氧的濃度不低于2 mg/L。

12.2 RNA 測(cè)序 使用TRIzol 等試劑提取斑馬魚(yú)胚胎中的mRNA，將其保存在RNA keeper 中。使用斑馬魚(yú)胚胎中提取到的mRNA 構(gòu)建cDNA 文庫(kù)，并在Illumina Hiseq 2000 測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 基因表達(dá)差異分析 得到RNA 測(cè)序表達(dá)譜后，采用DESeq2 軟件[10]分析不同濃度NGT 暴露下有顯著表達(dá)差異的基因。顯著差異的閾值設(shè)置為|log2FoldChange| ≥ 1 和P＜0.05。

1.2.4 Gene ontology（GO）富集分析 采用clusterProfiler軟件[11]對(duì)不同濃度NGT 暴露下有顯著表達(dá)差異的基因進(jìn)行GO 富集分析。設(shè)置P＜0.05 為顯著富集的GO 選項(xiàng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NGT 暴露下斑馬魚(yú)早期胚胎基因表達(dá)差異分析

試驗(yàn)共檢測(cè)到了32 520 個(gè)基因，比對(duì)5、50 ng/L NGT 處理組與空白對(duì)照組的基因表達(dá)，得到5 和50 ng/L NGT 暴露下斑馬魚(yú)差異表達(dá)的基因，如表1 所示。5 ng/L NGT 處理組中共有24 個(gè)基因的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著差異，其中22 個(gè)基因的表達(dá)量相比對(duì)照組上升，2 個(gè)基因的表達(dá)量相比對(duì)照組下降。以log2FoldChange 值作為差異程度指標(biāo)，表達(dá)上調(diào)幅度最大的基因?yàn)閟rsf3a，其log2FoldChange 值為3.66（P=1.71e-02）；表達(dá)下調(diào)幅度最大的基因?yàn)閑gr4，log2FoldChange 值 為-1.51（P= 7.14e-07）。 在50 ng/L NGT 處理組中，發(fā)生顯著差異表達(dá)的基因數(shù)僅有6 個(gè)，分別為fkbp5、cyldb、si:ch211-14i3.2、si:dkey-202l22.6、dhrs13a.2和CU137681.1。5 和50 ng/L NGT 處理組的差異表達(dá)基因具體分布情況如圖1 和圖2 所示，可以看出較低濃度NGT 暴露下斑馬魚(yú)胚胎的基因表達(dá)比較高濃度的NGT 暴露環(huán)境下有更大的差異。

圖1 5 ng/L NGT 處理組斑馬魚(yú)差異表達(dá)的基因

圖2 50 ng/L NGT 處理組斑馬魚(yú)差異表達(dá)的基因

表1 5 和50 ng/L NGT 暴露組顯著差異基因

2.2 差異基因富集分析

找到5 與50 ng/L NGT 處理組斑馬魚(yú)表達(dá)的差異基因之后，通過(guò)GO 功能富集，對(duì)這些差異基因?qū)?yīng)的分子功能以及它們影響的生理過(guò)程進(jìn)行注釋和分析，結(jié)果如表2 所示。5 ng/L NGT 暴露處理組中，差異表達(dá)的基因主要富集在與“基因表達(dá)的晝夜節(jié)律調(diào)控”“細(xì)胞核受體活性”“配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性”“類(lèi)固醇激素受體活性”“細(xì)胞成熟”等功能相關(guān)的GO選項(xiàng)中。其中，nr1d2a、nr1d1、per1a基因與晝夜節(jié)律調(diào)控有關(guān)；nr1d2a、nr1d1、nr4a1基因與細(xì)胞核受體活性、類(lèi)固醇激素受體活性有關(guān)；klf9、klf3基因則與細(xì)胞成熟，例如紅細(xì)胞的發(fā)育和成熟有關(guān)。而50 ng/L NGT 暴露處理組中，差異表達(dá)的基因主要富集在與“視網(wǎng)膜代謝過(guò)程”“藥物結(jié)合”“細(xì)胞醛代謝過(guò)程[酒精脫氫酶（NADP+）活性、醛酮還原酶（NADP）活性]”“烯化合物代謝過(guò)程”“視黃酸類(lèi)代謝過(guò)程”等功能相關(guān)的GO 選項(xiàng)中。其中，dhrs13a.2基因主要影響視網(wǎng)膜代謝、細(xì)胞中的醛代謝（包括NADP+活性和NADP 活性）和視黃酸類(lèi)代謝等生理功能；而fkbp5基因主要與藥物結(jié)合、蛋白質(zhì)肽基-脯氨酰異構(gòu)化、分子伴侶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊、肽基-輔氨酸修飾有關(guān)。

表2 5 和50 ng/L NGT 暴露組差異基因富集結(jié)果

3 結(jié)論與討論

將斑馬魚(yú)胚胎暴露在0～50 ng/L 的NGT 下，使用RNA 測(cè)序的方法，對(duì)不同濃度NGT 暴露下的斑馬魚(yú)胚胎的基因表達(dá)情況進(jìn)行比較分析，尋找不同濃度NGT 影響下產(chǎn)生表達(dá)差異的基因，并通過(guò)差異基因富集分析對(duì)這些差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能注釋?zhuān)业竭@些差異基因的功能和它們影響的代謝過(guò)程。結(jié)果表明，較低濃度NGT（5 ng/L）暴露下的斑馬魚(yú)胚胎，相比較高濃度NGT（50 ng/L）暴露下的斑馬魚(yú)胚胎，在基因表達(dá)層面表現(xiàn)出更強(qiáng)的差異性。Kumar 等[12]研究表明，左炔諾酮在濃度為0.8～1.0 ng/L 時(shí)能夠降低魚(yú)類(lèi)的產(chǎn)卵效率。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)其他人工合成孕激素類(lèi)物質(zhì)在低濃度下也會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)的內(nèi)分泌紊亂，阻礙其繁殖[13-15]。結(jié)合該研究中差異表達(dá)分析結(jié)果可知，以甲基炔諾酮為代表的激素類(lèi)藥物在低濃度下會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生更大的影響；而且，低濃度NGT 處理主要影響斑馬魚(yú)晝夜節(jié)律調(diào)控各類(lèi)受體和轉(zhuǎn)錄因子的活性以及細(xì)胞的發(fā)育和成熟，高濃度NGT 處理主要影響斑馬魚(yú)的視網(wǎng)膜代謝、細(xì)胞醛代謝、烯化合物代謝以及視黃酸類(lèi)代謝等新陳代謝過(guò)程。該研究結(jié)果在轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)層面為環(huán)境激素作用下斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育的研究提供支持。今后的斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育環(huán)境毒理研究可以在該研究基礎(chǔ)上進(jìn)行更深入地探索。