結核分枝桿菌Rv2941蛋白抗原表位集中區免疫原性研究

范雪亭，欒秀麗，趙秀芹，李馬超，萬康林，盧選成，李曉燕，劉海燦

結核病(Tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)引起的一種人獸共患病。它仍然是世界上傳染病中致命的主要原因之一，對人類健康造成巨大威脅[1-2]。據估計，全世界約1/4的人感染過結核，每年約150萬人死于結核病[3]。隨著耐藥結核菌感染以及HIV合并感染的出現，使得結核病的防治面臨更加嚴峻的挑戰。

目前，預防和控制傳染病最有效的方法是有效疫苗的預防接種?？ń槊?Bacillus Calmette Guérin，BCG)仍然是唯一批準用于人預防結核病的疫苗。有研究結果顯示，接種BCG可以有效預防兒童結核病，同時也可以為麻風病患者提供結核病保護[4-5]。BCG的保護效果可以持續5～10年，可能更長。但是，BCG對于預防成人結核分枝桿菌的感染以及結核病復發的效果具有較大差異，從0～80%不等[6-8]，以致認為無保護效果。因此，新型結核病疫苗及其免疫策略的研發變得十分迫切。國內外大量的研究者致力于尋找更為有效的結核病疫苗，主要包括以下幾種類型：①活菌疫苗，主要有重組BCG和結核分枝桿菌減毒活疫苗；②亞單位疫苗，主要有病毒載體疫苗、蛋白疫苗等；③滅活疫苗等。

Rv2941又名fadD28，屬于結核分枝桿菌脂肪?；鵄MP連接酶(fatty-acyl AMP ligase，FAAL)家族蛋白，與結核分枝桿菌毒力相關[9]。目前，國內外關于該抗原的研究較少，對其生物學功能了解較少。本研究將Rv2941的T細胞表位集中區(命名為Rv2941p)在大腸桿菌中表達，同時與佐劑PolyI:C和DDA混合免疫BALB/c小鼠，評價其免疫原性，旨在為篩選新型結核病疫苗優勢候選抗原提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒 本實驗中所用的大腸桿菌菌株DH5α和BL21(DE3)感受態購買自北京全式金生物技術有限公司，所用載體pET32a由本實驗室保存。

1.2 實驗動物 本實驗所用動物為6～8周齡SPF級BALB/c購買自斯貝福(北京)生物技術有限公司。所有動物實驗均在中國疾病預防控制中心實驗動物中心完成。

1.3 培養基及主要試劑 大腸桿菌使用LB培養基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化鈉，固體培養基中添加1.5%～2%瓊脂粉)培養。蛋白純化所用Ni-NTA填料購買自GE Healthcare公司；HRP標記的羊抗鼠二抗(IgG、IgG1、IgG2a)購買自Biotech公司；淋巴細胞分離液購買自達科為生物技術有限公司；蛋白轉運抑制劑(GolgiPlugTM Brefeldin A)、FITC標記的抗CD3抗體、BV421標記的抗CD4抗體、APC-Cy7標記的抗CD8抗體、PE-CF594標記的抗IL-4抗體、PE-Cy7標記的抗IFN-γ抗體以及BV650標記的抗TNF-α抗體均購自BD公司；免疫佐劑DDA和PolyI:C購買自Sigma公司。

1.4 重組質粒的構建 利用IEDB檢索結核分枝桿菌Rv2941(NCBI Gene ID：887454)基因T細胞表位集中區，選取表位集中區用于后續實驗。該段基因由生工生物合成連接至pET32a載體，命名為pET32a-2941p，用于后續實驗。

1.5 重組蛋白的表達與純化 將構建成功的重組質粒pET32a-2941p轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中。挑取單克隆于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃培養過夜后，按照1∶1 000的比例轉接至300 mL培養基中，當培養液OD值到達0.6～0.8時，加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG), 37 ℃震蕩培養4 h。

將培養后菌液4 000 r/min 離心10 min收集菌體。將菌體用普通裂解液(10 mmol/L pH8.0 Tris-HCl，10% TritonX-100)重懸后，超聲破碎10 min后12 000 r/min離心10 min。離心后上清用Ni親和層析純化，具體操作如下：上清中加入終濃度為500 mmol/L的NaCl后上樣于處理后的Chelating Sepharose Fast Flow層析介質中，待上樣完成后分別用含有30 mmol/L、60 mmol/L以及300 mmol/L咪唑的平衡液洗脫，洗脫液用SDS-PAGE電泳分析。將純化后的抗原利用BCA法檢測蛋白質濃度，-20 ℃保存備用。

1.6 動物免疫及抗體檢測 實驗選用SPF級6～8周齡的BALB/c 雌性小鼠，隨機將20只小鼠分成4組，每組5只小鼠，分別為PBS對照組、單獨佐劑組、Rv2941p混合佐劑組以及陽性對照組(Ag85B混合佐劑)，具體分組見表1。本研究選用DDA以及PolyI:C作為免疫佐劑，使用方法為抗原與佐劑按照體積1∶1混勻后乳化，經皮下多點免疫方式免疫3次，間隔周期為10 d。

表1 小鼠免疫實驗設計Tab.1 Experimetal design of mice immunization

在每次免疫前以及最后一次免疫后1周通過眼眶采血，將收集的血液在37 ℃靜置2 h，4 000 r/min離心10 min，收集血清，放于-20 ℃保存。利用ELISA法檢測血清中抗原特異性IgG抗體以及IgG亞型抗體滴度。

1.7 ELISA法檢測淋巴細胞細胞因子分泌水平 末次免疫后1周處死小鼠，取脾臟按照達科為淋巴細胞分離液說明書分離淋巴細胞，然后測定淋巴細胞濃度，將部分細胞濃度調整至2×105個細胞/mL，置于24孔板中，每孔500 μL，加入刺激抗原，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養48 h，收集細胞培養上清用于細胞因子檢測。ELISA法測定細胞因子使用BD公司生產小鼠細胞因子檢測試劑盒，檢測方法按照說明書進行。本研究主要檢測IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6。

1.8 流式細胞儀分析小鼠CD4+T、CD8+T細胞增殖及胞內細胞因子表達 將分離淋巴細胞調整濃度至2×106～3×106個細胞/mL，置于96孔板中，每孔100 μL細胞，加入蛋白轉運抑制劑以及刺激抗原，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養12 h后收集培養細胞。用50 μL Staining Buffer重懸細胞，然后加入7-ADD、CD3、CD4以及CD8抗體，4 ℃孵育30 min，用Staining Buffer清洗細胞2次。然后利用BD公司的固定破膜試劑盒將細胞進行破膜，破膜后加入IFN-γ、IL-4以及TNF-α抗體，4 ℃孵育30 min，然后Perm/WashTMbuffer清洗兩次，用50 μL Staining Buffer重懸細胞后加入250 μL 4%多聚甲醛溶液，上流式細胞儀檢測。

1.9 統計學分析 采用GraphPad Prim 5.0 中的Tukey的多重比較檢驗進行單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Rv2941基因T表位預測結果 利用IEDB數據庫分析后，結果如圖1。根據分析結果顯示，Rv2941的氨基酸第220位至第340位存在7個表位區(F004-F010)，占總表位數目的50%，同時考慮表位結構的完整性，因此，選擇核苷酸第649～1 017 bp即氨基酸第216位至第339位用于后續重組表達載體構建。

圖1 Rv2941基因T表位預測結果Fig.1 T cell epitopes prediction of Rv2941

2.2 重組蛋白的表達與純化 重組質粒pET32a-2941p由生工生物(上海)合成后，將質粒交由北京擎科生物科技有限公司測序，測序結果比對正確，用于后續實驗。在0.1 mmol/L IPTG，37 ℃誘導4 h后收集菌體，超聲破碎離心，SDS-PAGE電泳結果顯示在超聲上清樣品34 kDa處有明顯的表達帶，與目的蛋白大小一致，即該抗原在大腸桿菌表達系統中呈可溶性表達(圖2A)。利用His親和層析純化處理的超聲上清，電泳結果發現目的蛋白主要存在于300 mmol/L 咪唑洗脫液中，純化后的目的蛋白純度達98.89%(圖2B)，將蛋白分裝于-20 ℃保存以用于后續實驗。

A：Rv2941p小量表達(M：蛋白標準分子質量；1：陰性對照；2：全菌；3：沉淀；4：上清)；B：純化后蛋白(M：蛋白標準分子質量；1：洗脫目的蛋白)圖2 Rv2941p蛋白表達純化Fig.2 Expression and purification of Rv2941p

2.3 小鼠體內特異性抗體檢測 BALB/c小鼠第3次免疫后1周，利用ELISA法檢測血清中特異性IgG抗體滴度。結果顯示Rv2941p聯合佐劑使用后與單獨佐劑組以及PBS組間的差異有統計學意義(P<0.001)，即該蛋白作為抗原免疫小鼠，能產生高滴度的特異性抗體(圖3A)。然而，與Ag85B組相比， Rv2941p免疫小鼠產生的特異性抗體滴度較低，兩者間的差異有統計學意義(P<0.01)。

2.4 Rv2941p促進IgG2a抗體分化 處死前小鼠血清檢測IgG1和IgG2a抗體滴度，結果顯示Rv2941p和Ag85B都提高了IgG2a/IgG1比值，且Rv2941p比Ag85B高(圖3B)。

A：IgG抗體滴度；B：IgG亞型抗體滴度；①：P<0.01; ②：P<0.001圖3 體液免疫反應Fig.3 Humoral response

2.5 Rv2941p誘導的細胞免疫反應類型 為進一步評估Rv2941p作為疫苗候選抗原誘導的細胞免疫反應類型，本研究利用ELISA法檢測免疫48 h后小鼠脾臟淋巴細胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-2以及IL-6的水平。結果顯示，與佐劑組相比，Rv2941p顯著提高了IFN-γ的分泌，高達620 pg/mL，且差異具有統計學意義(F=5.193,P<0.001)。同時比Ag85B組(480 pg/mL)也顯著提高(F=1.152,P<0.001)(圖4A)。此外，與其他各組相比，免疫Rv2941p后顯著提高了IL-6細胞因子的分泌，高達2 600 pg/mL，是Ag85B的10倍(F=2.408，P<0.001)(圖4D)。而IL-2和IL-4各組分泌都較低(圖4B和4C)。同時，本研究利用流式細胞技術檢測淋巴細胞內IFN-γ、IL-4和TNF-α的分泌水平。與其他組相比，免疫Rv2941p后T細胞內IFN-γ的表達明顯提高(F=1.377，P<0.05)(圖5B)。免疫Ag85B和Rv2941p后，都提高了T細胞內TNF-α的表達，且兩組的表達水平幾乎一致(圖5B)。顯示Rv2941p誘導更強的Th-1類免疫反應。

A：IFN-γ分泌水平；B：IL-4分泌水平；C：IL-2分泌水平；D：IL-6分泌水平；①：P<0.05; ②：P<0.01; ③：P<0.001圖4 小鼠脾臟T淋巴細胞中細胞因子分泌水平Fig.4 Representative cytokine production in mouse spleen T cells after immunization

2.6 Rv2941p促進T淋巴細胞增殖 流式細胞技術分析免疫后小鼠脾臟T淋巴細胞內CD4+和CD8+細胞增殖分化情況。結果顯示，Rv2941p和Ag85B都提高了CD4+T和CD8+T細胞的比例(圖5A)。Rv2941p中CD4+T細胞比例比Ag85B中略低，而CD8+T細胞則比較高。

①：P<0.05圖5 T細胞增殖(A)及胞內細胞因子(B)表達情況Fig.5 Proliferation and cytokine profiles of T cells after immunization

3 討 論

盡管目前廣泛采用了標準藥物治療方案，現代診斷方法和疫苗(卡介苗)，但是全球結核病的流行仍未得到充分的控制，因此，研發新型安全有效的結核病疫苗迫在眉睫。而不管是亞單位疫苗還是重組BCG疫苗，篩選有效的抗原尤為關鍵。據研究報道，迄今為止，只有7%的結核分枝桿菌抗原能夠激活T細胞反應[10]。因此，在剩余的結核分枝桿菌抗原中篩選更多的免疫顯性T細胞表位至關重要。Rv2941是一種參與調控Mtb細胞壁脂質形成的基因，而這種脂質在致病Mtb逃避宿主的防御能力發揮重要作用[11]，但是對于該抗原的免疫原性未見報道，關于其T細胞表位區更是鮮有報道。因此，我們利用免疫表位數據庫(IEDB，https://www.iedb.org/)分析抗原Rv2941的T細胞表位區，根據分析結果選擇位于第649～1 017 bp的T細胞表位集中區進行免疫原性分析。

結核分枝桿菌是一種胞內寄生菌，寄生在特殊的囊泡和結核分枝桿菌吞噬體，因此，T細胞免疫對結核免疫至關重要，尤其是Th-1類免疫反應[12]。IgG1和IgG2a分別是代表Th-2和Th-1型反應的重要生物標志物[13]。本研究發現Rv2941p可以促進IgG2a的分化，提高IgG2a/IgG1的比值，這一結果表明Rv2941p傾向于刺激機體Th-1類免疫反應。此外，本研究中還檢測了Th-1類細胞因子IFN-γ和IL-2，結果顯示免疫Rv2941p后，小鼠脾臟淋巴細胞IFN-γ和IL-2的分泌顯著提高，尤其是IFN-γ，這一數據也表明Rv2941p可以刺激機體產生較強的Th-1類免疫反應。

在結核分枝桿菌感染中，IL-6是激活分泌IFN-γ的T細胞的關鍵，同時是一種主要的誘導保護性T細胞的分子，加強IFN-γ的作用[14]。本研究證實Rv2941p可以明顯促進T淋巴細胞分泌IL-6細胞因子，高達2 600 pg/mL(圖4D)，這一結果為Rv2941p可以作為結核病新型疫苗候選抗原提供依據。

在小鼠感染模型研究中證實CD4+T和CD8+T細胞在抗結核免疫中發揮關鍵作用。CD4+T細胞可以與感染Mtb的巨噬細胞相互作用，通過分泌細胞因子(如IFN-γ等)限制結核分枝桿菌在細胞內的復制。同時，CD8+T細胞分泌穿孔素裂解Mtb感染的巨噬細胞和直接殺死細胞內Mtb[15]。本研究發現，Rv2941的T細胞表位區(Rv2941p)顯著提高了CD4+和CD8+T細胞的增殖分化(圖5A)。另外，有研究證實，IFN-γ、TNF-α、IL-12以及IL-17的表達是對抗結核的保護性免疫的重要指標，特別是對高毒性結核分枝桿菌譜系[16]。本研究利用流式細胞技術發現淋巴細胞胞內CD4+T細胞內IFN-γ和TNF-α的表達水平較高(圖5B)，IFN-γ和TNF-α屬于Th-1類細胞因子，這一結果表明Rv2941p可以加強CD4+Th-1類免疫反應。同時，從人類疾病和實驗小鼠模型中可以明顯看出，結核分枝桿菌特異性CD4+和CD8+T細胞產生的IFN-γ和TNF-α都是控制結核分枝桿菌感染的基礎[17]。這些結果都提示Rv2941p的T細胞表位區可能是潛在結核病疫苗抗原。

B細胞在介導結核病疫苗效力方面的作用也在逐漸凸顯，但是尚未完全了解其具體功能。在動物模型和人類感染的相關研究已經提供了明確的證據，即增殖的抗原特異性B細胞定殖于保護性肉芽腫內，這些肉芽腫是高度特殊化的空間結構，可以控制Mtb的進一步感染[18]。因此，除了T細胞外，B細胞有可能也參與疫苗誘導有效的抗結核病免疫反應的產生。本研究也證實Rv2941p可以刺激機體產生較強的IgG抗體，這一結果表明它可以刺激機體產生較強的體液免疫反應。

綜上所述，本研究發現Rv2941的T細胞表位區核苷酸第649～1 017 bp具有較強的免疫原性，可以刺激機體產生較強的Th-1類免疫反應，可以作為結核病新型疫苗的候選抗原之一。

利益沖突：無

引用本文格式：范雪亭，欒秀麗，趙秀芹，等. 結核分枝桿菌Rv2941蛋白抗原表位集中區免疫原性研究[J]. 中國人獸共患病學報，2022，38(5)：394-399. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.061