2019-2020年寧夏炭疽芽胞桿菌毒力鑒定及基因分型研究

楊 聰，高建煒，馬江濤，海 娥，鄒 悅，陳麗莉，李小璐，韓 坤，張術斌

炭疽是由炭疽芽胞桿菌引起的一種人獸共患傳染病。主要傳染源為牛、羊、馬等食草動物，人因接觸患病動物而被感染[1]。寧夏是炭疽自然疫源地，自2014年以來疫情呈現(xiàn)上升趨勢，且疫源地面積較廣，防控難度逐漸增大[2]。有研究發(fā)現(xiàn)炭疽芽胞桿菌的致病力與其毒力因子有關，當菌體中具有毒力因子即可判定為強毒菌株[3]。由于炭疽芽胞桿菌遺傳進化相對保守，導致其基因缺乏遺傳多樣性，目前常用的基因分型技術主要有可變數目串聯(lián)重復序列(multiple locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)和單核苷酸多態(tài)性(canonical single nucleotide polymorphism, canSNP)兩種，對揭示菌株的遺傳進化特征具有重要意義[4]。為了解寧夏炭疽芽胞桿菌的致病力和基因分型特征，揭示菌株間的遺傳特征及基因型別，本研究對2019-2020年寧夏各地區(qū)分離到的炭疽芽胞桿菌進行了相關試驗研究，以期為疫情溯源提供線索和科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 本研究所用菌株為2019-2020年本實驗室收集保存的臨床分離菌株，共分離到4株炭疽芽胞桿菌，全部分離自患者皮膚滲出液(表1)。

表1 2019-2020年寧夏臨床分離炭疽芽胞桿菌菌株信息Tab.1 Background information on strains of B. anthracis in Ningxia from 2019 to 2020

1.2 試驗材料 Tag DNA聚合酶、無菌水、DNA Marker2000購自全式金生物有限公司；核酸提取試劑盒(QIAGEN DNA Mini Kit)購自德國QIAGEN公司；血瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂購自青島海博生物有限公司。MLVA-15各位點引物由上海生工生物公司合成；SNP探針及引物由中國疾控中心傳染病所提供；ABI7500Fast熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 方 法

1.3.1 菌株基因組DNA的提取 按照QIAGEN試劑盒步驟提取。

1.3.2 毒力鑒定 采用文獻報道的4個毒力因子位點[5]設計引物(表2)。反應體系為25 μL：含Tag DNA聚合酶12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板3 μL，無菌水7.5 μL。擴增參數為：95 ℃預變性5 min； 95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min， 30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

表2 毒力因子引物序列信息Tab.2 Information on primer sequences for virulence genes

1.3.3 MLVA-15分型 將分離到的菌株提取核酸后，采用參考文獻[6]報道的引物序列和PCR方法擴增菌株的15個可變重復序列(VNTR)位點。PCR擴增反應體系為20 μL：含Tag DNA聚合酶10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，無菌水6 μL。擴增參數為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。其中vrrB1、vrrB2位點退火溫度為55 ℃，VNTR12、VNTR16、VNTR 17、VNTR 35位點退火溫度為52 ℃，其余反應條件均相同。將擴增為陽性的樣品送往上海生工生物公司進行測序。

1.3.4 canSNP分型 根據文獻[6]報道的炭疽芽胞桿菌的13個SNP位點，使用TaqMan探針法對菌株的核酸進行檢測。建立20 μL擴增體系，包含：Tag DNA聚合酶10 μL，上下游引物及探針各0.4 μL，DNA模板1 μL，無菌水7.4 μL。擴增條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，45個循環(huán)；40 ℃ 30 s。使用熒光定量PCR儀7500FAST進行擴增。根據所檢測到的熒光信號，對照探針序列，確定所檢測的SNP位點是哪一種核苷酸。

2 結 果

2.1 炭疽芽胞桿菌毒力鑒定情況 通過對分離到的4株炭疽芽胞桿菌基因組DNA經普通PCR擴增，結果顯示在900 bp、923 bp、373 bp和1 242 bp處分別出現(xiàn)目標條帶(圖1)，由此可判定這4株炭疽芽胞桿菌均為強毒菌株。

A：擴增Lef基因；B：擴增Pag基因；C：擴增Cap基因；D：擴增Cya基因注：M為2 kb DNA Marker；5、11、17、23為陰性對照；6、12、18、24為陽性對照；其余膠孔為檢測樣本。圖1 2019-2020年炭疽芽胞桿菌毒力基因PCR產物電泳圖Fig.1 Detection on virulence genes of B. anthracis by PCR

2.2 MLVA-15分型 通過對分離到的4株炭疽芽胞桿菌基因組DNA進行MLVA-15分型，結果顯示4株炭疽芽胞桿菌在15個VNTR多態(tài)性位點處的擴增產物大小均相同(表3)，屬于同一個種群，結果提示該種群菌株可能是寧夏的主要流行菌群。

表3 2019-2020寧夏炭疽芽胞桿菌VNTR位點擴增產物Tab.3 Amplification results of the VNTR locus of B. anthracis in Ningxia from 2019 to 2020

2.3 canSNP分型 通過對分離到的4株炭疽芽胞桿菌基因組DNA進行canSNP分型，并與文獻比對位點的變異情況(表4)，結果顯示4株炭疽芽胞桿菌均為A.Br.001/002型，是我國最常見的SNP基因型。

3 討 論

炭疽是一種嚴重的人獸共患自然疫源性傳染病，呈現(xiàn)世界范圍內流行。不僅能使人和動物發(fā)病甚至死亡，還是一種潛在的生物戰(zhàn)劑，可引起嚴重的公共衛(wèi)生問題[7]。人感染炭疽，根據感染途徑不同，可分為肺炭疽、腸炭疽和皮膚炭疽，其中皮膚炭疽最為常見。寧夏是皮膚炭疽疫情高發(fā)省份之一，據記載自1958年起就有病例報告，2004-2018年平均報告發(fā)病率高于全國[2]；且寧夏地處西北內陸高原，有天然的草場，牛羊養(yǎng)殖貿易發(fā)展迅速，周邊省份均有皮膚炭疽疫情，存在疫情輸入的風險，因此，寧夏皮膚炭疽疫情防控壓力和難度較大。雖然有針對寧夏皮膚炭疽流行特征及炭疽芽胞桿菌的實驗室檢出情況的報道[8-10]，但缺乏對引起皮膚炭疽疫情的病原菌的致病力強弱及基因分型方面的研究。

炭疽芽胞桿菌的基因組是由1個環(huán)狀染色體和2個質粒(PXO1和PXO2)組成，主要致病因子位于這2個質粒上。當炭疽芽胞桿菌同時具有這兩種毒性質粒時，菌體就會有很強的致病力，一旦失去其中一個因子，致病力會隨之下降[11]。本研究發(fā)現(xiàn)2019-2020年分離到的4株炭疽芽胞桿菌均為強致病力的菌株，且分離到菌株的患者臨床癥狀較為嚴重[12]。推測菌株致病力的強弱可能與患者臨床癥狀具有一定的相關性。

炭疽芽胞桿菌在外界環(huán)境中可形成芽胞從而導致菌株的遺傳學性狀較為穩(wěn)定，而細菌學常用到的隨機擴增多態(tài)性DNA分子標記技術及脈沖場凝膠(PFGE)電泳分子分型技術僅能鑒定到種屬間的差異[13]。目前常用于炭疽芽胞桿菌基因分型的方法主要有MLVA和canSNP兩種。其中MLVA分型方法證明可用于鑒別炭疽之間的差異及多樣性，通過區(qū)分基因組上不同串聯(lián)重復序列(VNTR)的重復數鑒別菌株，是較好的分子分型方法之一[14]。且有學者對我國北方省份106株臨床分離的炭疽芽胞桿菌進行了MLVA-15分型，共分成36個基因型，極大的豐富了我國炭疽芽胞桿菌基因型別[15]。本研究運用MLVA-15分型技術對2019-2020年寧夏分離到的炭疽芽胞桿菌桿菌進行基因分型，雖然菌株來源于不同縣區(qū)不同年份，但結果表明4株分離菌株屬于同一個種群，提示菌株間存在流行病學關聯(lián)。canSNP是一種在地理分布上進行溯源的基因分型方法[4]。據報道中國境內的炭疽芽胞桿菌共分為5種canSNP型別，分別為A.Br.001/002、A.Br.008/009、A.Br.Vollum、A.Br.Aust.94和A.Br.Ames。本研究結果顯示2019-2020年分離到的4株的炭疽芽胞桿菌canSNP型別為A.Br.001/002型，此種型別在貴州、云南、陜西、內蒙古等地方均有分布，是我國最為常見的SNP基因型[16-19]。

本研究對2019-2020年寧夏分離的炭疽芽胞桿菌菌株進行了初步的毒力鑒定及基因分型研究，了解了寧夏炭疽芽胞桿菌致病力及分子遺傳特征。由于菌株分離率較低，用于實驗研究的樣本和來源較為局限，應當對更多的菌株進行基因分型研究，用于揭示寧夏炭疽芽胞桿菌的基因型別和分子流行病學特征，為本地炭疽疫情的預警和防控提供更全面的實驗室數據。雖然寧夏皮膚炭疽目前處于較低的散發(fā)水平，但由于疫源地消毒效果不明、農民防控意識淡薄、牲畜交易控制難度較大等原因，寧夏皮膚炭疽疫情仍然存在擴散傳播的風險。因此，今后應提升實驗室檢測能力，提高炭疽芽胞桿菌的分離率并加強分子生物學檢測溯源工作，為更好的控制疫情提供有力保障。

利益沖突：無

引用本文格式：楊聰，高建煒，馬江濤，等. 2019-2020年寧夏炭疽芽胞桿菌毒力鑒定及基因分型研究[J].中國人獸共患病學報，2022，38(5)：447-450，457. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.060