重慶地區結核分枝桿菌異煙肼和丙硫異煙胺耐藥及其交叉耐藥相關基因突變研究

朱大冕，劉文果，沈 靜，余鋒平，孔玨穎，馮 鑫，胡 彥

耐多藥結核病(MDR-TB)是指體外藥敏試驗證實對利福平和異煙肼同時耐藥的結核病。根據2020年世界衛生組織報告，2019年全球約有39萬例MDR-TB患者，我國約有5.46萬例[1]。異煙肼(isoniazid,INH)是結核病標準化療方案的核心藥物[2]。結核分枝桿菌(MTB)對INH耐藥后，多采用丙硫異煙胺(protionamide,Pto)代替INH進行治療。乙硫異煙胺(ethionamaide,Eto)/Pto用于MDR-TB治療，是目前WHO推薦的MDR-TB治療藥物之一[3]。異煙肼和Eto/Pto的作用機制是抑制MTB分枝酸的合成[2]，兩藥存在部分交叉耐藥機制[4]，inhA基因及其調控區域突變就是其主要分子機制之一[5]。

本研究將探討MTB對INH與Pto的耐藥情況，采用序列分析的方法檢測INH耐藥相關基因，分析INH與Pto交叉耐藥相關基因inhA突變特點，為耐藥基因型檢測奠定基礎，也為臨床治療MDR-TB提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選用2014年9月至2019年3月期間來源于重慶39個區縣的233株INH耐藥MTB臨床分離株以及5株全敏感MTB；中國疾病預防控中心結核病預防控制中心國家結核病參比實驗室提供標準株H37Rv。

1.2 試劑 分離培養、菌種鑒定、藥敏試驗所用試劑均購于珠海貝索生物技術有限公司。培養基內藥物終濃度分別為：INH 0.2 μg/mL，RFP 40 μg/mL，SM 4 μg/mL，EMB 2 μg/mL，Ofx 4 μg/mL，Km 30 μg/mL，Cm 40 μg/mL，Pto 40 μg/mL，PAS 1 μg/mL，AK 30 μg/mL。

1.3 藥敏試驗及鑒定 藥敏試驗采用比例法，將稀釋好的菌懸液分別接種于對照、含藥及PNB和TCH培養基，37 ℃培養3～4周。根據耐藥百分比判讀：耐藥百分比=(含藥培養基生長的菌落數/對照培養基生長的菌落數)×100%。若耐藥百分比大于1%，則認為受試菌對該抗結核藥耐藥。

1.4 DNA提取 取適量新鮮菌苔于0.5 mL去離子水，85 ℃金屬浴30 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清；0.5 mL TE緩沖液，100 ℃金屬浴20 min；12 000 r/min離心5 min，取上清即為DNA模板。

1.5 基因擴增 耐藥相關基因測序使用引物見表1。引物由北京擎科生物技術有限公司合成。反應體積為50 μL，其中DNA 4 μL，Master MIX 25 μL，引物各2 μL，其余由17 μL滅菌蒸餾水補足。擴增條件為：98 ℃預變性2 min；98 ℃ 30 s，退火 30 s(溫度根據引物各不同)(表1)，72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。

表1 耐藥相關基因測序使用引物Tab.1 Primers used for sequencing drug resistance associated genes

1.6 測序及結果分析 采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，送北京擎科生物技術有限公司雙向測序。測序結果與NCBI上的katG、inhA、ahpC、kasA基因標準序列進行比對，運用MEGA 6.0進行突變分析。

1.7 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件分析數據。計數資料比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 藥敏結果 共收集到233株IHN耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株，其中37株與Pto交叉耐藥，交叉耐藥率(15.8%)。233株菌株中MDR-MTB有194株(83.2%)， 前廣泛耐藥結核分枝桿菌(pre-XDR-MTB:在對INH和RFP耐藥的基礎上,同時對二線注射類藥物或氟喹諾酮類藥物中的一種藥物耐藥)有82株(35.2%)，廣泛耐藥結核分枝桿菌(XDR-MTB)有8株(3.4%)。菌株來源患者中，男性173例(74.2%)、女性60例(25.8%)，患者平均年齡為46.3歲。詳見表2。

表2 各因素對結核分枝桿菌INH和 Pto耐藥的影響Tab.2 Effects of various factors on the resistance of MTB to INH and Pto

2.2 耐藥基因測序結果katG突變情況：標準株及5株全敏感菌株均未檢測到katG突變。233株耐異煙肼菌株中亦未有katG完全缺失。223株 (96.5%)耐藥株katG存在點突變、插入，其中 2個突變位點未見報道(D448G，D419H)。其中195株 (83.6%) 315位點突變 (S315T 188株，S315N 4株，S315I 1株，S315R 2株)；189株 (81.1%)463位點突變(R463L)，166株 (71.2%)與315位點聯合突變。其他位點突變4株，包括D448G 1株、D419H 1株、2株同義突變。另1株在位點1180/1181插入CG。

inhA突變結果：標準株及5株全敏感菌株均未檢測到inhA突變。233株INH耐藥株中11株(4.7%)inhA發生點突變，包括S94A 1株、I194T 1株、C-15T 9株(有4株與katGS315T聯合突變)。另有3株發生同義突變。37株Pto耐藥的菌株中，8株發生點突變且均為C-15T，其中4株katGS315T和inhAC-15T雙基因聯合突變，余4株均為inhA單基因點突變C-15T。

aphC突變結果：標準株及5株全敏感MTB未發現aphC基因突變，233株異煙肼耐藥菌中有1株菌株Leu106Val突變。

kasA突變結果：標準株及5株全敏感MTB未發現kasA基因突變，233株異煙肼耐藥菌未有kasA基因突變。詳見表3。

表3 233株異煙肼耐藥菌株基因突變類型及位點情況Tab.3 Gene mutation types and sites in 233 isoniazid resistant strains

3 討 論

異煙肼是結核病治療的核心藥物, 通過結核分枝桿菌過氧化氫酶過氧化物酶(katG編碼)活化為殺菌形式。若katG發生突變，異煙肼活化效率降低或不能活化，導致結核分枝桿菌對異煙肼發生不同程度的耐藥[6-7]。其他異煙肼耐藥相關基因突變也參與異煙肼耐藥，如inhA、ahpC、kasA等。其中，inhA是活化的異煙肼作用靶,inhA與kasA編碼的蛋白合成酶參與分枝菌酸的生物合成，ahpC參與氧化-應激應答 (oxidativestress)[8]。

本項研究中，233株耐異煙肼菌株katG和inhA突變率分別為96.5%(223/233)、4.72%(11/233)，二者的總突變率為98.7%(230/233)。katG第315位點突變是katG最常見的突變類型，本項研究katG315位點突變率為83.6%(195/233)，與尼泊爾(81.4%)[9]及福建(86.7%)[10]相似，高于華東地區 (64.4%)[11]的報道，提示此位點突變發生率存在著區域性差異。據報道，katG315位點突變可能是由于katG氧化酶活性喪失且保留其過氧化氫酶活性，而這種基因的修飾具有生存優勢，很容易在人群中傳播，這也是其成為主要突變類型的原因之一[12-13]。本研究中katG315位點突變類型以S315T 188株最常見，其次為S315N 4株(2.1%)，另S315R有2株、S315I僅1株。而katG463位點突變率(81.1%)雖較高，但據文獻報道這主要是由于其所在的區域相對不穩定、極易發生改變所致，此位點的突變與INH耐藥無關[14]。INH耐藥菌株中inhA發生點突變率為4.72%(11/233)，包括9株inhA啟動子突變、2株inhA基因突變。inhA啟動子突變以C-15T最為常見。國內外報道耐異煙肼菌株中，inhA基因突變所占比例從12%～60%不等[15-18]，可見inhA基因突變存在著明顯的地區性差異。

文獻報道inhA基因突變常伴有katG突變，二者對INH有協同耐藥作用[19]，本研究中11株inhA基因突變中4株伴katGS315T突變，也證實這點。Seifert等[20]對2000-2013年的來自49個國家的118篇關于INH耐藥基因突變的研究進行了系統綜述，發現全球INH耐藥菌株64%與katG基因315相關，19%由inhA基因-15位點突變所致。由于大多數MTB耐藥發生于katG基因315和inhA基因-15位點，這兩個位點已成為INH耐藥基因檢測的主要位點。本項研究中，katG315位點突變率83.6%，inhA-15位點的突變率4.72%，二者聯合突變4株，檢測此兩個基因位點可檢測出耐藥基因突變率為85.8%(200/233)，證實通過這兩個位點的耐藥基因型檢測是可行的。

1株ahpC突變菌株對異煙肼耐藥，可能是ahpC突變增強了AhpC的表達，降低過氧化物的濃度，進而抑阻了katG介導的異煙肼活化。233株異煙肼耐藥菌未發現有kasA基因突變，與陳曦[6]、Mdluli[21]等國內外學者的研究結果不同，估計與擴增區域不同以及突變地區間差異有關,同時最近有報道kasA酶對INH耐藥影響尚有爭議[22-23]，kasA基因突變與INH耐藥的關系還需進一步研究。

Pto屬碳硫胺類似藥，作用機制與INH相似，需被MTB細胞質氧化還原酶作用成為細胞毒性成分，進而使MTB細胞膜不能合成霉菌酸及失去酸性，以此發揮抗結核功效[24]。兩種藥有共同的作用靶點：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)，NADH依賴的烯酰-ACP還原酶(InhA,Rv1484)[25]。因此，inhA基因、inhA調控區域的突變，可致使inhA靶標過度表達或者修飾﹐降低與NAD之間親和力而產生INH與Pto交叉耐藥[23,26-27]。

本研究中，37株INH與Pto共同耐藥菌株中，inhA發生點突變率為21.6%(8/37)，8例均為inhA基因-15位點突變；雖有4例與katG基因聯合突變，但Morlock等[26]研究表明未發現katG基因突變與Pto耐藥相關。進一步證實Pto耐藥與inhA基因-15位點突變密切相關，INH與Pto之間存在一定的交叉耐藥率，且交叉耐藥菌株中inhA基因-15位點突變最常見。雖有1例inhA啟動子區域C-15T位點突變存在于INH耐藥Pto敏感菌株，但可能與其他調節因子的代償突變有關[28]。如研究所示，inhA基因-15位點突變在INH耐藥株中所占比例較小,且傳統藥敏試驗結果顯示，INH與Pto的交叉耐藥也只有15.8%。因此，INH耐藥特別是無inhA突變的患者可選擇Pto替代INH進行治療。

綜上所述，本研究發現重慶地區異煙肼耐藥菌株基因突變率較高，大多數發生于katG基因315位點和inhA基因-15位點，通過檢測這兩個基因位點的分子耐藥診斷學方法可以在重慶地區得到很好的應用，指導臨床用藥。同時INH與Pto存在著一定的交叉耐藥，但耐藥率較低，為INH耐藥及耐多藥結核病化療方案中Pto的合理選擇提供參考；Pto耐藥的發生與inhA基因-15位點突變密切相關，這為inhA基因突變應用于INH與Pto交叉耐藥快速診斷奠定了基礎。

利益沖突：無

引用本文格式：朱大冕，劉文果，沈靜，等. 重慶地區結核分枝桿菌異煙肼和丙硫異煙胺耐藥及其交叉耐藥相關基因突變研究[J].中國人獸共患病學報，2022，38(5)：405-409. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.047