杭州市1 731株結核分枝桿菌耐藥狀況分析

黃銀燕，吳亦斐，賈慶軍，程慶林，方子健，謝 立

結核病(Tuberculosis，TB)是全球十大死亡原因之一，主要是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起，以潛伏期長，致死率高為主要特征。2020年全球約有987萬人感染結核病，發病率為127/10萬,較往年有所減緩。2015-2020年結核病發病率累計下降了11%，但未達到WHO提出的2020年終止結核病策略的要求。各國結核病流行的嚴重程度差異較大，30個結核病高負擔國家占全球所有估算發病率的86%，其中最嚴重的8個國家：印度(26%)、中國(8.5%)、印度尼西亞(8.4%)、菲律賓(6.0%)、巴基斯坦(5.8%)、尼日利亞(4.6%)、孟加拉國(3.6%)和南非(3.3%)，占總數的2/3。2020年所有新發病例中，成年男性患者占56%，成年女性占33%，兒童占11%。2020年全球新發耐多藥結核病(multi-drug resistance tuberculosis，MDR-TB)和利福平耐藥結核病(Rifampicin resistance tuberculosis，RR-TB)患者有132 222例，廣泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)患者有25 681例[1]。

我國是結核病高負擔國家，根據世界衛生組織2021年的統計數據， 2020年估算的結核病新發患者數為84.2萬(2019年為83.3萬)，估算發病率為59/10萬(2019年為58/10萬)，占全球總結核病患者的8.5%,僅次于印度[1]，較2019年略有上升。結核病的防控形勢依舊嚴峻，耐藥結核病防控形勢也不容樂觀，2019年全球新發耐藥結核病患者中我國占14%，僅次于印度[2]。

研究顯示，杭州市的結核病患者耐藥率2011年是31.3%[3]，2015年是22.3%[3]，2017年是20.1%[4]，耐多藥率2011年是11.6%[3]，2015年是8.0%[3]，2017年是3.74%[4]，均呈下降趨勢。本研究對2018年1月至2019年12月分離自杭州市周邊7個縣區的1 975份診斷為肺結核病人的培養菌株進行藥物敏感性實驗和菌種鑒定，分析這些地區耐藥結核病的流行狀況，優勢耐藥譜，不同地區間耐藥率的比較，初治和復治病人耐藥狀況，以及結合前幾年的研究數據，比較初治和復治病人耐藥率的變化趨勢，為提供更有效的耐藥結核病防控策略提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 菌株來自2018年1月至2019年12月杭州市余杭區、蕭山區、富陽區、臨安區、建德市、桐廬縣、淳安縣結核病定點醫院肺結核病人的痰培養陽性標本。痰培養按照《結核病實驗室檢驗規程》[5]分離分枝桿菌，酸性羅氏培養基購自杭州市創新生物技術有限公司。

1.2 分枝桿菌菌種鑒定 菌種鑒定采用硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼生長實驗,具體操作參照文獻[5-6]。在噻吩-2-羧酸肼培養基上生長，而硝基苯甲酸培養基上不生長，則為人型結核分枝桿菌(Mycobacteriatuberculosis)，在兩種培養基上都不生長，則為牛型結核分枝桿菌(Mycobacteriabovis)，均屬于結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)。在兩種培養基上均生長，則為非結核分枝桿菌(Nontuberculous mycobacteria，NTM)，硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼培養基購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3 分枝桿菌藥物敏感性實驗 分枝桿菌藥物敏感實驗按照《結核病實驗室檢驗規程》[5]采用比例法進行操作。液體培養的結核分枝桿菌轉種至羅氏培養基，待生長后采用比例法。藥物包括異煙肼(Isoniazid, INH)、利福平(Rifampicin, RFP)、鏈霉素(Streptomycin, SM)、乙胺丁醇(Ethambutol, EMB)、氧氟沙星(Ofloxacin, OFX)、卡那霉素(Kanamycin, KM)，培養基藥物終濃度依次為0.2 μg/mL、40 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、2 μg/mL、30 μg/mL。具體操作參照文獻[5-6]，INH、SM、RFP、EMB購自杭州市創新生物技術有限公司，OFX、KM購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.4 相關定義 一線抗結核藥物包括異煙肼、利福平、利福噴丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素。二線抗結核藥物包括卡那霉素、氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、乙硫(丙硫)異煙胺、對氨基水楊酸、阿米卡星、卷曲霉素、利奈唑胺、貝達喹啉、德拉馬尼、氯法齊明。本研究中使用的一線藥物為異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇，二線藥物為氧氟沙星、卡那霉素。

耐藥類型分為：①單耐藥，指僅對1種一線抗結核藥物耐藥；②一線藥物耐藥,指對1種或1種以上一線抗結核藥物耐藥；③多耐藥， 指對 1 種以上一線抗結核藥物耐藥，但不包括同時對 INH 和 RFP耐藥；④耐多藥結核病， 指至少同時對INH和RFP耐藥；⑤廣泛耐藥結核病，指在耐多藥的基礎上至少同時對 1 種氟喹諾酮類和 1 種二線注射類抗結核藥物耐藥；⑥RFP 耐藥結核病， 指對 RFP 耐藥， 包括對 RFP 耐藥的上述所有耐藥結核病類型(單耐藥、 多耐藥、 耐多藥、 廣泛耐藥結核病)[7]。

初治肺結核患者指有下列情況之一者：①從未因結核病使用過抗結核藥物治療的患者；②正進行標準化療方案規律用藥而未滿療程的患者(登記分類以治療開始時為準)；③不規則化療未滿1個月的患者。復治肺結核患者指有下列情況之一者：①因結核病不合理或不規律服用抗結核藥物治療≥1個月的患者；②初治失敗和復發患者[5]。

1.5 統計分析 采用EXCEL軟件整理數據，用SPSS 22.0進行統計分析。各組耐藥率比較用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 分枝桿菌菌種鑒定結果 1 975份培養菌株中，鑒定為結核分枝桿菌占87.6%(1 731/1 975)，鑒定為非結核分枝桿菌占12.4%(244/1 975)。

2.2 結核分枝桿菌的耐藥率 1 731株結核分枝桿菌中，對受試藥物全敏感的菌株占81.74%(1 415/1 731)株，18.26%(316/1 731)菌株至少對一種受試藥物耐藥，其中初治患者總耐藥率為17.74%(270/1 522)，復治患者總耐藥率為22.01%(46/209)，初、復治耐藥率差異無統計學意義(χ2=2.245，P>0.05)。在6種受試藥物中，INH的耐藥率最高，為10.05%(174/1 731)。其余5種藥物耐藥率從高到低依次是SM(9.01%)、OFX(4.74%)、RFP(3.24%)、EMB(2.14%)、KM(0.35%)，6種藥物的初治耐藥率和復治耐藥率高低排序不變。1 731株結核分枝桿菌中，14.96%(259/1 731)對一線藥物耐藥；4.97%(86/1 731)對二線藥物耐藥；單耐藥、多耐藥、耐多藥、廣泛耐藥、利福平耐藥的耐藥率分別是11.84%(205/1 731)、3.81%(66/1 731)、2.60%(45/1 731)、0.06%(1/1 731)、3.24%(56/1 731)。見表1。

表1 1 731株結核分枝桿菌的耐藥率Tab.1 Drug resistance rates of 1 731 M. tuberculosis strains

2.3 結核分枝桿菌耐藥譜 在28種耐藥譜中(表2)，耐2、3、4、5種藥的組合中優勢耐藥譜分別為INH+SM(2.43%)、INH+RFP+SM(0.58%)、INH+RFP+SM+EMB(0.58%)、INH+RFP+SM+EMB+OFX(0.58%)。有1例復治病人對6種藥物均耐藥。

表2 耐藥結核分枝桿菌的耐藥譜Tab.2 Drug resistance spectrum of drug-resistant M. tuberculosis

2.4 不同臨床特征的肺結核患者的耐藥情況分析

1 731例檢出結核分枝桿菌病例中，男性1 245例(71.92%)，女性486例(28.08%)，其中男女性患者的任一藥物耐藥率差異無統計學意義(χ2=0.427，P>0.05)，男性患者耐多藥率顯著高于女性(χ2=8.423，P<0.05)。從患者年齡層次看，60周歲以上患者有830例，占比最高(47.95%)。不同年齡段對任一藥物的耐藥率差異有統計學意義(χ2=8.114,P<0.05)，0～20歲患者任一藥物耐藥率最低(8.1%)；不同年齡段耐多藥率差異無統計學意義(χ2=2.417，P>0.05)。見表3。

表3 不同臨床特征的肺結核患者的耐藥情況分析Tab.3 Analysis of clinical drug resistance of patients with tuberculosis with various clinical characteristics

2.5 不同地區耐藥率分析 在7個區縣中，臨安區總耐藥率、初治耐藥率最高，富陽區初治耐多藥率最高，建德市復治耐藥率、總耐多藥率、復治耐多藥率最高。淳安縣總耐藥率、初治耐藥率最低。蕭山區初治、復治、總耐多藥率均最低，有4個區縣的復治耐多藥率都為0。見表4。

表4 2018-2019年杭州市不同地區結核耐藥率分析Tab.4 Analysis of TB drug resistance rates in different counties of Hangzhou in 2018-2019

2.6 2011年、2015年、2018-2019年耐藥率變化分析 對比2011年、2015年、2018-2019年這3個時間段的數據(表5)，其中，2011年、2015年數據來源于文獻[3]。一線藥物、RFP、SM的總耐藥率、初治患者耐藥率及復治患者耐藥率以及耐多藥、INH、EMB的總耐藥率及復治耐藥率呈現下降趨勢(均P<0.05)。但2018-2019年二線藥物OFX的總耐藥率和初治患者耐藥率較2015年升高(均P<0.05)。

表5 2011年、2015年、2018-2019年杭州市縣域結核病人耐藥率變化分析Tab.5 Trends in drug resistance prevalence among patients with tuberculosis in suburban Hangzhou in 2011, 2015 and 2018-2019

3 討 論

世衛組織2020年的統計數據顯示，2019年全球新發結核病患者中MDR/RR的占比是3.3%，復治患者MDR/RR的占比是18%，我國的數據分別是7.1%和23%[2]。國內一項回顧性研究顯示，2014-2018年的總耐多藥率為14.6%[8]。國內其他地區近年的報道顯示：貴州的總耐多藥率為14.3%[9]；四川的總耐多藥率為13.3%[10]；河北的總耐多藥率為13.2%[11]；北京的總耐多藥率為9%[12]；上海的總耐藥多率為5%[13]；陜西省研究965株MTB的耐多藥率為6.53%[14]；天津市研究2006—2017年20 212株MTB的耐多藥率為12.29%[15]。杭州市2018-2019年初復治患者的MDR/RR均低于全球和全國平均水平。

2011年、2015年、2018-2019年杭州市結核病定點醫院收治的結核病人的耐藥率呈下降趨勢(表5)。復治病人除OFX和KM以外的耐藥率均呈下降趨勢。2018-2019年初、復治病人對不同藥物的耐藥率差異無統計學意義(P>0.05)，這在之前的研究中較為少見。杭州市從2016年加入中國國家衛生和計劃生育委員會與蓋茨基金會結核病防治合作項目三期(中蓋結核病三期)，積極推廣結核病分子診斷技術，實現了分子診斷技術區縣范圍全覆蓋，使得耐多藥結核病的診斷時間從2個月縮短至2 h，大大提高了耐藥結核病的診療技術，降低了耐藥率。上海的一項研究顯示，傳播是引起耐藥結核病的主要原因[16]。另一項研究也顯示60%的耐多藥病人是傳播所致[17]。杭州市開展的DOTS-PLUS項目，為耐藥結核病的診斷、管理、治療提供了新的策略：一方面，從一定程度上阻斷了耐藥病人的傳播；其次，診斷、治療水平的提升，減少了獲得性耐藥的發生；再次，杭州市區縣定點醫院的復治病人比例逐年降低，從2013-2016年的17.22%[18]、2017年的14.37%[4]，下降到2018-2019年的12.07%，隨著交通便利，部分復治病人會選擇去市級定點醫院就醫，也是復治病人耐藥率下降的一個原因。

對于利福平敏感肺結核的治療，使用一線抗結核藥物治療。本研究中，4種一線藥物耐藥率最高的是異煙肼(10.05%)，其次是鏈霉素(9.01%)，但這兩種藥物的耐藥率2018-2019年相較于2011年和2015年均下降(異煙肼：χ2=52.270，P<0.05；鏈霉素：χ2=43.003，P<0.05)。這說明目前采用聯合用藥降低耐藥率的方法是有效的。二線藥物中氧氟沙星的耐藥率高達4.7%，相對于2015年(2.6%)升高(χ2=8.976，P<0.05)。2020版《中國結核病預防控制工作技術規范》[19]關于利福平耐藥患者的治療方案，左氧氟沙星、莫西沙星是首選藥物。本研究中，同時耐利福平和氧氟沙星的耐藥率為0.81%，而利福平的耐藥率是3.24%，即每4個利福平耐藥患者中，有1個患者耐氧氟沙星，這個比例值得臨床醫生關注。

從結核病患者年齡層次看，60歲以上結核病患者占比最大(47.95%)。我國的人口老齡化程度進一步加深，第七次人口普查顯示我國60歲及以上人口已超2.64億，占總人口的18.70%。老年人免疫力下降，基礎疾病較多，更易患結核病。這提示我們要重點防控老年人結核病。研究顯示不同年齡階段對任一藥物的耐藥率存在差異，40～60歲最高，0～20歲最低；而對于任一藥物耐藥，男女不存在差異，但對于耐多藥患者，男性高于女性。江蘇連云港的一項研究也顯示對任一藥物耐藥率，28～54歲的最高，0～28歲最低，但性別對于耐藥沒有差異[20]。

不同地區耐藥率分析提示我們要重點關注富陽區，臨安區耐藥病人的管控。尤其是富陽區初治耐多藥率最高，從該區分離的耐多藥病人57.14%居住地為同一街道。我們擬對2018年以后分離自富陽區的耐多藥結核分枝桿菌進行全基因組測序，從基因組角度進行溯源。 建德市復治耐藥率、復治耐多藥率較高，提示我們在督導時要重點關注定點醫院的診療能力和病人的依從性。

利益沖突：無

引用本文格式：黃銀燕，吳亦斐，賈慶軍，等. 杭州市1 731株結核分枝桿菌耐藥狀況分析[J].中國人獸共患病學報，2022，38(5)：410-416，422. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.048