重癥肺結(jié)核患者T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子的表達及其預(yù)后意義

吳多池，鐘業(yè)騰，王玉峰, 吳燁瑩，趙慶珠

肺結(jié)核的主要致病菌為結(jié)核分枝桿菌，其主要臨床表現(xiàn)為四肢乏力、低熱、盜汗，并伴有咳嗽、咳痰、咯血等，且部分患者可出現(xiàn)呼吸困難，該病能夠使機體多個器官受到牽連[1-2]。隨著病情加重，可發(fā)展為以大咯血、呼吸衰竭、結(jié)核性腦膜炎等為主要特征的重癥肺結(jié)核。據(jù)臨床報道，全球每年新增肺結(jié)核患者至少987萬例，其已發(fā)展為全球范圍內(nèi)較為致命的一種感染性疾病[3]。諸多臨床研究結(jié)果顯示[4-6]，肺結(jié)核的進展一方面與致病菌的數(shù)量、毒性關(guān)系密切，另一方面與機體自身的免疫狀態(tài)有關(guān)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)是一種特定表達于Th1和Th2上的Ⅰ型膜表面蛋白分子，其在機體免疫功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[7]。TIM-3是臨床最早發(fā)現(xiàn)的TIM分子，其屬于免疫負調(diào)控分子之一，可在T細胞、樹狀細胞等細胞表面進行表達，能參與CD4+T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)；TIM-1可在CD8+T淋巴細胞中的增殖、分化等方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。目前，臨床尚無重癥肺結(jié)核患者中TIM-1、TIM-3水平變化的相關(guān)報道。本研究通過檢測外周血T細胞亞群(CD4+、CD8+)、TIM-1、TIM-3在重癥肺結(jié)核患者中的表達，并與健康人群進行比較，旨在探討其與病情嚴重程度、預(yù)后等關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019年1月至2021年6月在我院收治的1 056例重癥肺結(jié)核患者的臨床資料，并將其定義為重癥肺結(jié)核組，另隨機選取同期在我院進行治療的1 000名輕癥肺結(jié)核者作為輕癥肺結(jié)核組。納入標準：年齡20～60歲者；符合中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布的《肺結(jié)核診斷》[8]中有關(guān)重癥肺結(jié)核診斷標準者；經(jīng)影像學和實驗室生化指標檢查確診者；病灶范圍至少3個肺葉，且形成空洞者；需長期排痰，并伴有顯著的結(jié)核中毒癥狀者；以往從未采用免疫抑制劑治療者。排除標準：經(jīng)痰培養(yǎng)結(jié)果顯示為陰性者；合并其他惡性腫瘤者；伴有慢阻肺、哮喘和支氣管擴張等其他類型感染性疾病者；臨床資料不全者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準同意，且所有納入對象均知情同意。

1.2 方法 采集兩組納入患者的晨起空腹靜脈血8 mL，其中5 mL用于T淋巴細胞亞群及熒光定量PCR檢測，另3 mL離心取血清備用。

1.2.1 檢測TIM-1、TIM-3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平 采用熒光定量PCR(南京學靜生物科技有限公司，型號：ABI QuantStudio 5，原產(chǎn)地：新加坡)檢測提取待測的PBMC mRNA的表達情況，具體步驟：1)采用密度梯度離心法分離PBMC；2)采用淋巴細胞分離液(美國GE公司)將外周血淋巴細胞分離，然后按照說明書要求提取外周血淋巴細胞中含有的RNA并純化，對純化后的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；3)采用熒光定量PCR檢測PBMC中TIM-1、TIM-3 mRNA水平，β-actin基因為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 PCR擴增引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR

1.2.2 采用流式細胞分析法測定T淋巴細胞亞群及TIM-1、TIM-3水平 將抗體CD4-FITC/CD8-PE分別加入標本，經(jīng)充分震蕩、避光、室溫孵育，15 min后做溶血處理。完畢后后采用全自動細胞檢測儀(上海巴玖實業(yè)有限公司，型號：bio-rad TC20，原產(chǎn)地：美國)檢測外周血CD4+、CD8+及TIM-1、TIM-3水平。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；計量資料的組間比較用獨立t檢驗，檢驗水準α=0.05。TIM-1、TIM-3與CD4+、CD8+間行 Spearman相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較 兩組納入對象的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學意義(t=0.913,χ2=1.322,均P>0.05)，兩組有可比性，見表2。

表2 兩組納入對象一般資料比較Tab.2 Comparison of general data between groups

2.2 兩組外周血CD4+、CD8+、TIM-1、TIM-3水平比較 重癥肺結(jié)核組CD8+、TIM-1和TIM-3水平均高于輕癥肺結(jié)核組(tCD8+=24.388,tTIM-1=17.821,tTIM-3=47.465,均P<0.001)，CD4+水平低于輕癥肺結(jié)核組(t=40.971，P<0.001)，見表3。

表3 兩組外周血CD4+、CD8+、TIM-1、TIM-3水平比較Tab.3 Comparison of peripheral blood CD4+, CD8+, TIM-1 and TIM-3 levels between groups %]

2.3 兩組TIM-1、TIM-3的mRNA水平比較 重癥肺結(jié)核組TIM-1 mRNA和TIM-3 mRNA水平均高于輕癥肺結(jié)核組(tTIM-1=42.046,tTIM-3=35.218,均P<0.001)，見表4。

表4 兩組TIM-1、TIM-3的mRNA水平比較Tab.4 Comparison of TIM-1 and TIM-3 mRNA levels

2.4 重癥肺結(jié)核患者TIM-1、TIM-3與預(yù)后的關(guān)系

1 056例重癥肺結(jié)核患者在治療過程中存活605例，死亡451例。

表5 存活組與死亡組臨床資料比較Tab.5 Comparison of clinical data between the survival group and death group

2.4.2 存活組與死亡組CD4+、CD8+、TIM-1、TIM-3水平比較 死亡組CD8+、TIM-1和TIM-3水平均高于存活組(tCD8+=11.650,tTIM-1=13.411,tTIM-3=18.613,均P<0.001)，CD4+水平低于存活組(t=23.722，P<0.001)，見表6。

表6 兩組外周血CD4+、CD8+、TIM-1、TIM-3水平比較Tab.6 Comparison of peripheral blood CD4+, CD8+, TIM-1 and TIM-3 levels between groups

2.4.3 存活組TIM-1、TIM-3與CD4+、CD8+水平間的相關(guān)性水平比較 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：存活組患者TIM-1、TIM-3與CD4+均呈負相關(guān)(r值分別為-0.114和-0.211，P<0.05)，而與CD8+均呈正相關(guān)(r值分別為0.571和0.680，P<0.05)。

3 討 論

肺結(jié)核作為一種慢性感染性疾病，據(jù)WHO最新調(diào)查結(jié)果顯示，中國的肺結(jié)核患者在全球中的占比為9%左右，該病負擔在全球排名第2[9]。當前，雖然大部分人群已接種卡介苗，但耐多藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)，導(dǎo)致肺結(jié)核患者呈上升趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，當機體感染結(jié)核分枝桿菌后并不會立即發(fā)作，而是當機體免疫功能減弱或出現(xiàn)細胞介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)升高，細菌大量增生后可致病，若期間未采取綜合措施，可致病情進展為重癥肺結(jié)核[10]。一旦形成重癥肺結(jié)核，可致機體肺組織發(fā)生大范圍的空洞，或出現(xiàn)大量的纖維化等，進而使得患者合并呼吸衰竭，對其生命安全造成嚴重影響。

有報道顯示，外周血T淋巴細胞的表達與重癥肺結(jié)核的預(yù)后轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切[11]。結(jié)核分枝桿菌作為肺結(jié)核的主要致病菌，其屬于胞內(nèi)病原體，而抗致病菌的免疫機理則是以T淋巴細胞產(chǎn)生的細胞免疫為主，體液免疫將不占據(jù)主導(dǎo)地位。在細胞免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是CD4+T淋巴細胞亞群。CD4+T淋巴細胞亞群能夠在機體內(nèi)釋放不同類型的細胞因子，主要類型包括Th1和Th2兩個亞型，各個因子之間互相協(xié)同，發(fā)揮各自的生物學效應(yīng)，最大程度的在機體內(nèi)發(fā)揮免疫保護作用，CD8+T淋巴細胞亞群的主要作用是打破結(jié)核分枝桿菌的生存環(huán)境，并抑制其增殖分化，進而保護機體[12-13]。有學者通過搜集106例重癥肺結(jié)核患者的研究資料，分析其病情，研究其與T淋巴細胞間的關(guān)系，結(jié)果表明，當機體出現(xiàn)T淋巴細胞表達失調(diào)，且失調(diào)程度越顯著，病情程度越嚴重[14]。本研究結(jié)果表明，重癥肺結(jié)核組CD8+水平高于輕癥肺結(jié)核組，CD4+水平低于輕癥肺結(jié)核組，并且死亡組CD8+水平高于存活組，CD4+水平低于存活組，且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：存活組患者TIM-1、TIM-3與CD4+均呈負相關(guān)，而與CD8+均呈正相關(guān)。說明T淋巴細胞亞群在體內(nèi)的表達與機體抗結(jié)核分枝桿菌的能力有關(guān)，提示其與疾病的轉(zhuǎn)歸、預(yù)后關(guān)系緊密。

多數(shù)研究結(jié)果證實，T細胞的有效活化及功能介導(dǎo)一方面需要特異性抗原信號，另一方面則與協(xié)同刺激分子提供的信號密不可分[15-17]。有學者指出[18]，在機體內(nèi)一旦出現(xiàn)TIM分子(TIM-1和TIM-3)的表達變化極可能造成細胞免疫紊亂。TIM-3是目前臨床研究較為關(guān)注的負性系統(tǒng)刺激因子，其是由外國學者在尋找Th1和Th2兩個亞型細胞表面的特異性標志物的過程中發(fā)現(xiàn)的。TIM-3的主要作用是與其配體相結(jié)合，進而對Th1細胞的免疫功能進行下調(diào)，并誘導(dǎo)、促使聚集的Th1細胞發(fā)生凋亡。通過對乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等傳染性疾病的研究，均能夠發(fā)現(xiàn)TIM-3能夠有效抑制T細胞的增殖，將該通路上的信號進行阻斷時，能夠利于T淋巴細胞亞群抗病毒免疫應(yīng)答的部分作用，進而發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。TIM-1能夠在病毒感染性疾病中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[19-20]。本研究結(jié)果顯示，重癥肺結(jié)核組TIM-1和TIM-3水平均高于輕癥肺結(jié)核組，且TIM-1 mRNA和TIM-3 mRNA水平均高于輕癥肺結(jié)核組。同時，死亡組TIM-1和TIM-3水平均高于存活組。提示TIM分子有可能是重癥肺結(jié)核進展中的一個關(guān)鍵靶點，并對機體的細胞免疫功能造成一定影響。但本研究也有一定的局限性，搜集的樣本為單中心樣本，且考察指標具有一定的局限，不能完全闡述TIM分子與其它指標關(guān)聯(lián)性，這仍需后續(xù)研究以證實。

綜上所述，重癥肺結(jié)核患者免疫功能紊亂可能與其體內(nèi)外周血T細胞亞群水平異常以及TIM-1、TIM-3 高表達有關(guān)，后期對相關(guān)指標檢測可利于對病情整體的把控。

利益沖突：無

引用本文格式：吳多池,鐘業(yè)騰,王玉峰，等. 重癥肺結(jié)核患者T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子的表達及其預(yù)后意義[J].中國人獸共患病學報，2022，38(5)：400-404. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.049