Illumina MiSeq對熱帶環境血蜱屬成蜱內共生真菌多樣性分析

蘆亞君，袁傳飛，解蕓蕓，夏 琪，夏乾峰

蜱是寄生于多種動物體表的專性吸血節肢動物，宿主廣泛，具有叮咬宿主吸血及更換宿主的習性。蜱是多種病原體的儲存宿主和傳播媒介[1]。蜱媒傳染病種類多、范圍廣，已逐漸成為全球倍受關注的公共衛生問題，威脅人類健康和畜牧業的發展[2]。其中，血蜱屬是引起嚴重危害的重要蜱屬[3]。蜱媒病的傳播與蜱的地理分布、自然環境、宿主行為等因素密切相關。溫暖、潮濕的熱帶地區有蜱媒病逐步增加的趨勢[4-5]。

真菌和昆蟲都是物種極其繁多的類群。真菌廣泛存在于幾乎所有昆蟲的體內，與昆蟲存在著共生關系[6]。昆蟲與真菌之間的共生關系包括雙方都受益的互惠共生關系、只有一方受益的片利共生關系、一方受益另外一方受損的寄生關系及雙方均受損的競爭關系[7]。真菌具有非常豐富的生物多樣性，這也決定了天然代謝產物的化學多樣性[8]，揮發性和非揮發性的代謝產物可為昆蟲宿主提供抵抗病原細菌的能力[9]。

昆蟲體內的共生真菌群落組成具有高度動態變化特征，其相對豐度也隨著自然環境、氣候條件及昆蟲不同的發育階段轉換而發生變化[10-11]。昆蟲與內共生真菌之間存在復雜的相互作用關系體現在昆蟲為真菌提供物理防護、生長條件和營養來源等；真菌及其代謝產物可影響昆蟲攝食行為、提供營養元素，或者某些病原真菌可導致昆蟲受損、死亡等[12]。微生物組學、轉錄組學、代謝組學等多組學研究[13]有助于更清晰地揭示真菌-昆蟲互作的生物學現象及發生機制。本文以Illumina MiSeq高通量測序技術分析海南熱帶環境中植被表面上血蜱屬成蜱的內共生真菌的群落組成及多樣性，有助于探索蜱與真菌的互作關系及熱帶環境對蜱與真菌共進化的生態驅動因素。

1 材料與方法

1.1 蜱蟲采集 使用布旗法[14]于海南省海口市郊區自然環境中的植被表面采集蜱，置于透氣細胞培養瓶內保存。

1.2 形態學分類 采集后的蜱在尼康ECLIPSE Ni-E正置研究級顯微鏡下觀察，根據外部形態特征和典型結構，篩選出血蜱屬成蜱作為本實驗的研究對象[15]。

1.3 蜱蟲基因組DNA提取 取1只成蜱，用無菌生理鹽水清洗3次，置于1.5 mL無菌離心管中，加入100 μL動物組織直接PCR試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)中的 AB溶液和研磨珠，置于高效組織細胞破碎儀(湖北新縱科病毒疾病工程技術有限公司)中，5 000 r/min 研磨30 s，重復5次，加25 μL AD Buffer，室溫放置10 min后，95 ℃孵育5 min，加入100 μL AC溶液后即為蜱基因組DNA粗提物。

1.4 蜱蟲分子鑒定 擴增COⅠ基因的上游引物COI-F：5′-GAGTCGGTAAAATGGCGCTAC-3′，下游引物COI-R：5′-GCTATCTTTAAGAGGGTAATA-3′[16](天一輝遠基因科技有限公司合成)。PCR體系總體積為20 μL：2×PCR Mix 10 μL，上游引物、下游引物各0.8 μL，蟲體粗提物4 μL，dd H2O 4.4 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃后延伸10 min。取5 μL PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統觀察結果，并對PCR產物進行純化、測序(華大基因科技有限公司)。所得序列在NCBI中進行BLAST比對。

1.5 Illumina高通量測序和數據分析 取20只成蜱，體表分別用75%乙醇和無菌生理鹽水各清洗3次，研磨后的蟲體組織以蛋白酶K裂解法提取基因組DNA。使用兩步PCR法構建文庫。擴增真菌ITS1基因的引物為ITS1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和ITS1-R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

一次PCR擴增體系50 μL，含5×PCR Buffer 10 μL，dNTPs (10 mmol/L) 1 μL，Phusion超保真DNA 聚合酶(南京諾唯贊生物科技有限公司) 0.5 μL，引物F(5′-TTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)/ R(5′-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′) (10 μmol/L) 各1 μL，基因組DNA 1 μL，dd H2O 35.5 μL。PCR反應程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循環40次；72 ℃ 5 min。取3 μL PCR產物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒(愛思進生物技術有限公司)將目的片段進行純化，純化產物進行二次PCR擴增。二次PCR擴增體系40 μL，含5×PCR Buffer 8 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL，Phusion 超保真DNA 聚合酶0.4 μL，引物F(5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-ACAC-barcode-TCTTTCCCT-ACACGACGCTC-3′)/ R (5′-CAAGCAGAAGA-CGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3′) (10 μmol/L) 各1 μL，模板DNA 5 μL，dd H2O 23.6 μL。PCR反應程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環8次；72 ℃ 5 min。PCR產物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測、進行純化后構建文庫。

以Illumina MiSeq平臺進行高通量測序(微基生物科技有限公司)，將測序得到的有效序列進行質控、過濾、拼接，得到優化序列。優化序列使用mothur V.1.39.5軟件進行OTU(Operational Taxonomic Units)聚類分析及alpha多樣性分析。

2 結 果

2.1 蜱分子鑒定及系統發育分析 COⅠ基因PCR擴增產物在650～750 bp之間有特異性條帶。測序結果經NCBI數據庫中BLAST比對結果顯示蜱蟲樣本為血蜱屬(Haemaphysalisspp.)，覆蓋度為100%，相似度為89.52%。

2.2 真菌OTU聚類分析 高通量測序后有效序列數是45 858，優化序列數為44 073，堿基個數11 876 878，GC含量為49.02%，序列長度為183～433 bp，平均長度為269 bp(圖1A，圖1B)，聚類為245個OTU。在序列相似性為97%以上的OTU稀釋性曲線(rarefaction curves)顯示該組數據具有足夠的測序深度(圖1C)。豐度等級曲線(rank abundance curves)不平滑，表明245個OTU聚類的物種分布不均勻(圖1D)。

A：有效序列長度；B：優化序列長度；C：稀釋性曲線；D：豐度等級曲線圖1 海南熱帶環境血蜱屬內共生真菌OTU聚類分析Fig.1 OTU cluster analysis of the endosymbiotic fungi in Haemaphysalis spp. from tropical environments in Hainan

2.3 真菌群落組成分析 血蜱屬成蜱體內真菌群落組成(圖2)，在各個分類階元上具有明確分類信息，且按相對豐度排序，其群落構成分布于3個門，分別是子囊菌門(Ascomycota)占80.56%、擔子菌門(Basidiomycota)占15.43%及接合菌門(Zygomycota)占0.37%。綱水平的群落組成分布于19個綱，排在前3位分別是座囊菌綱(Dothideomycetes)占52.48%、銀耳綱(Tremellomycetes)占9.34%及糞殼菌綱(Sordariomycetes)占7.94%；目水平的群落組成分布于12個目，排在前3位分別是煤炱目(Capnodiales)占35.84%、格孢腔菌目(Pleosporales)占14.62%及銀耳目(Tremellales)占8.71%；科水平的群落組成分布于20個科，排在前3位分別是球腔菌科(Mycosphaerellaceae)占18.49%、小戴衛霉科(Davidiellaceae)占6.45%及畸球腔菌科(Teratosphaeriaceae)占3.11%；屬水平的群落組成分布于29個屬，排在前3位分別是平臍疣孢屬(Zasmidium)占8.99%、枝孢屬(Cladosporium)占6.45%及亞隔孢殼屬(Didymella)占4.31%；種水平的群落組成分布于22個種及未明確分類地位物種，排在前3位分別是Zasmidiumcitri-griseum占7.72%、皺枝孢(Cladosporiumdelicatulum)占6.43%及Pseudocercosporadovyalidis占3.76%。

A：門水平物種分布；B：綱水平物種分布；C：目水平物種分布；D：科水平物種分布；E：屬水平物種分布；F：種水平物種分布圖2 海南熱帶環境血蜱屬內共生真菌群落組成Fig.2 Endosymbiotic fungal community composition in Haemaphysalis spp. from tropical environments in Hainan

2.4 真菌Alpha多樣性分析 Alpha多樣性包括菌群多樣性指標Shannon指數、Simpson指數；以及菌群豐度指標Chao指數和Ace指數。Shannon指數和Simpson指數反映了群落中的生物多樣性，Shannon指數通常在0～5之間，大于1說明該群落具有較高的生物多樣性。Shannon指數為4.45(圖3A)，說明該樣本具有較高的真菌多樣性[17-18]。Simpson指數無限接近于0，表示群落中生物多樣性越高。Simpson指數為0.022 5(圖3B)，說明該樣本具有較高的真菌多樣性。Shannon指數和Simpson指數一致說明本研究中的血蜱屬樣本體內真菌具有較高的多樣性[19]。

Chao指數和ACE指數反映樣品中群落的豐富度。在一定數量范圍內，Chao指數和ACE指數的曲線迅速上升至245(圖3C，圖3D)，隨著序列數的增加，曲線平緩，趨于飽和，測序深度基本覆蓋所有物種[20-21]。

A：Shannon指數；B：Simpon指數；C：Chao指數；D：Ace指數圖3 海南熱帶環境血蜱屬內共生真菌Alpha多樣性分析Fig.3 Alpha diversity analysis of the endosymbiotic fungi in Haemaphysalis spp. from tropical environments in Hainan

3 討 論

蜱媒病是影響人類健康的一個顯著危險因素。蜱在溫帶地區具有季節消長，而在熱帶地區全年可見。全球變暖的氣候變化、寵物增加、畜牧業發展、戶外旅游和探險活動增加，均導致蜱媒病感染呈上升趨勢[22]。海南省是我國熱帶省份，全年長夏無冬、植被茂密，非常適合蜱孳生、活動，具有蜱媒病傳播的自然條件。

蜱內共生真菌報道極少，本文以熱帶環境植被表面上的游離血蜱為研究對象，以真菌ITS1基因進行高通量測序，探討血蜱屬成蜱內共生真菌的群落組成，分析其多樣性。來自熱帶環境植被表面的血蜱屬成蜱內共生真菌聚類為245個OTU，且物種分布不均勻。在高階元分類水平上，優勢菌門為子囊菌門(Ascomycota)，其次為擔子菌門(Basidiomycota)。Alpha多樣性分析數據表明血蜱屬成蜱內共生真菌具有十分豐富的生物多樣性。

內共生真菌的群落組成及其天然代謝產物是否影響蜱的生理變化，包括棲息特征、侵襲行為及宿主選擇的偏好性等，還需進一步探討。研究蜱與內共生真菌的互作關系、內共生真菌代謝產物與細菌之間的拮抗作用、熱帶環境的生態驅動能力及病原真菌在控蜱方面的應用[23]，都為深入了解蜱的行為特征及建立有效的生物學防控措施提供了新的思路。

利益沖突：無

引用本文格式：蘆亞君，袁傳飛，解蕓蕓，等. Illumina MiSeq對熱帶環境血蜱屬成蜱內共生真菌多樣性分析[J].中國人獸共患病學報，2022，38(5)：441-446. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.047