KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 在鼻咽癌中的表達及其與患者預后的關系

施雨南，陳志平，肖秋香，周春燕，張珊毓，衷敬華

（1.贛南醫學院第一臨床醫學院，江西 贛州 341000；2.贛南醫學院第一附屬醫院檢驗科，江西 贛州 341000；3.贛南醫學院第一附屬醫院病理科，江西 贛州 341000；4.贛南醫學院第一附屬醫院腫瘤科，江西 贛州 341000）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）在我國華南地區較常見。鼻咽癌可局部侵襲和轉移至區域淋巴結及身體其他部位[1]。近年來，雖然調強放療技術（IMRT）有了很大的改善，但鼻咽癌總體5 年生存率并沒有明顯改善[2]。轉移和復發是治療失敗的主要原因[3]。鼻咽癌的進展和轉移與一些分子變化密切相關，但這些分子目前很少能用于預測預后。KAI1又稱CD82，是位于人類染色體11p11.2 上的四倍體蛋白家族的重要成員。KAI1 最初被認為是前列腺癌細胞轉移的抑制因子，該基因編碼10 個外顯子和9個內含子。KAI1 基因在生物行為中錯綜復雜，包括移動、遷移、粘附、融合和侵襲[4]。研究表明，KAI1 的異常表達與許多人類癌癥的發生發展密切相關。越來越多的證據表明，KAI1 可能是一種重要的生物標志物，用于預測胃癌、結直腸癌、前列腺癌[5]的侵襲、轉移和預后。上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞在特定的生理和病理條件下轉化為間充質細胞，同時上皮標記物（如E-cadherin、CK)表達減少，間充質標記物（如vimentin、Twist、Slug、Snail）表達增加。EMT 被認為是腫瘤侵襲和轉移的關鍵步驟。Snail 又稱鋅指轉錄因子，是EMT 過程中的關鍵轉錄因子。通過與啟動子中的E-box 結構結合，抑制E-cadherin 的轉錄，導致細胞間粘附減少，誘導EMT 的發生，促進浸潤轉移[6，7]。轉錄因子Slug 也屬于鋅指結構家族，與Snail結構相似，是高度保守的羧基末端，帶有一個可變的氨基末端，包含4～6 個鋅指結構，也是EMT 過程的重要調控因子[8]。Slug 還通過與目的基因上的E-box結構結合抑制E-cadherin 的表達，促進EMT 的形成。E-cadherin 是維持細胞形態和結構完整的重要分子，普遍存在于各種上皮細胞中，主要介導細胞間的粘附反應，起細胞骨架的作用。E-cadherin 表達減少或丟失與腫瘤分化不良、高侵襲、高轉移、腫瘤復發呈正相關。它是預測腫瘤進展和預后的重要指標，是腫瘤侵襲轉移的抑制因子[9]。然而，在鼻咽癌中，KAI1 與Snail、Slug、E-cadherin 在EMT 過程中的作用尚未完全明確。本研究主要觀察KAI1 和Snail、Slug、E-cadherin 表達、相關性及對預測鼻咽癌的預后作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011 年6 月-2015 年7 月贛南醫學院第一附屬醫院病理科存檔石蠟包埋的212 例鼻咽癌組織標本（未行放療或化療），50 例鼻咽部黏膜炎組織標本，正常鼻咽上皮組織標本40 例，收集了患者臨床病理特征和隨訪數據。本研究根據《赫爾辛基宣言》指南進行，并獲得贛南醫學院第一附屬醫院倫理委員會的授權[10]。患者TNM 分期根據美國癌癥聯合委員會（AJCC）[11]發布的指南第8 版進行評估。血漿中EB 病毒DNA（EBV-DNA）陽性定義為血漿中EB 病毒DNA 拷貝數超過500 拷貝/ml。隨訪至患者死亡或至2020 年7 月，隨訪時間為12～84個月。根據WHO 組織分型標準，212 例鼻咽癌中198 例為非角化性鱗狀細胞癌，14 例為角化性鱗狀細胞癌；診斷時中位年齡為46.5 歲（27～82 歲），≥60 歲135 例，＜60 歲77 例；男139 例，女73 例；EBDNA 陽性188 例，陰性24 例；腫瘤直徑≥3.0 cm 126 例，＜3.0 cm 86 例；206 例出現頸部淋巴結轉移（≥N1）；遠處轉移（M1）30 例；根據TNM 分期標準，Ⅰ+Ⅱ期16 例（7.54%），Ⅲ+Ⅳ期196 例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學 將鼻咽癌組織、鼻咽部黏膜炎組織和正常鼻咽組織標本固定在10%的緩沖形成液中，石蠟包埋，切成4 μm 厚的薄片。免疫組化染色采用Elivision TM Plus 法，所有的切片用二甲苯脫蠟，用酒精脫水，然后用常規H2O2溶液猝滅內源性過氧化物酶活性，抗原用檸檬酸緩沖液修復，用山羊血清阻斷所有組織。KAI1（小鼠單克隆抗體，Abcam，USA）、Slug 和Snail（小鼠單克隆抗體）；E-cadherin（兔多克隆抗體；Assay Biotech，USA），加入一抗，所有切片在4 ℃孵育過夜。加入增強劑（試劑A和試劑B），所有薄片在二氨基聯苯胺（DAB）溶液中顯影。所有的切片都用蘇木精浸泡，脫水，固定。

1.2.2 免疫組化染色評價 考慮到腫瘤內的異質性，在每個鼻咽癌切片中隨機指定10 個高倍視野（HPF），根據陽性細胞和陽性染色強度，將染色結果乘以百分比和強度評分。百分比評分：＞11%為1 分，11%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。強度評分：未染色為0 分，弱染色為1 分，中等染色為2 分，強染色為3 分，評分范圍為0～12 分。當最終評分為＞2 分時，Slug 和Snail 的表達為陽性。

1.3 統計學分析 應用SPSS 20.0 軟件分析本實驗數據，計量資料數據以采用（）表示，行t檢驗；計數資料以[n（%）]表示，行X2檢驗；采用Fisher 精確檢驗或X2比較臨床特征與KAI1、Snail、Slug、Ecadherin 的相關性；采用列聯表資料的關聯性分析比較KAI1 與Snail、Slug 與E-cadherin 之間的關系；采用單因素和多因素分析確定KAI1、Snail、Slug或E-cadherin 對生存率的影響；獨立預后因素采用Cox 回歸模型進行多因素分析；采用Kaplan-Meier法結合Log-rank 檢驗進行單因素總生存分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 在鼻咽癌組織中的表達及與臨床特征的相關性 Snail 陽性表達主要位于細胞核，鼻咽癌組織中Snail 表達陽性率[65.09%（138/212）]高于鼻咽部黏膜炎組織[34.00%（17/50）]和正常鼻咽上皮組織[5.00%（2/40）]，差異有統計學意義（P＜0.05）；Slug 陽性表達主要位于細胞質中，鼻咽癌組織中Slug 陽性表達率[65.09%（138/212）]高于鼻咽部黏膜炎組織[36.00%（18/50）]和正常鼻咽上皮組織[5.00%（2/40）]，差異有統計學意義（P＜0.05）；KAI1 的陽性表達主要位于細胞質和細胞膜，KAI1在鼻咽癌組織中的表達陽性率[25.94%（55/212）]低于鼻咽部黏膜炎組織[68.00%（34/50）]和正常鼻咽上皮組織[90.00%（36/40）]，差異有統計學意義（P＜0.05）。E-cadherin 在鼻咽癌組織中的表達陽性率[31.60%（67/212）] 低于鼻咽部黏膜炎組織[72.00%（36/50）]和正常鼻咽上皮組織[90.00%（36/40）]，差異有統計學意義（P＜0.05）；鼻咽癌中Snail、Slug 表達陽性率與EB-DNA 水平、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期呈正相關；鼻咽癌中KAI1、Ecadherin 的表達陽性率與EB-DNA 水平、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM 分期呈負相關。鼻咽癌組織中KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 的表達與年齡、性別、組織分型無相關性（P＞0.05）；見圖1、表1。

圖1 KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 在鼻咽癌組織中的表達（DAB 染色×400）

表1 KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 與鼻咽癌臨床病理特征的相關性（n）

表1 （續）

2.2 鼻咽癌中KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 的相關性KAI1 表達與Snail、Slug 呈負相關，與E-cadherin 呈正相關；E-cadherin 表達與Snail 和Slug 呈負相關；Snail 與Slug 表達呈正相關，見表2。

表2 鼻咽癌中KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 的相關性（n）

2.3 單因素和多因素分析影響鼻咽癌患者預后的危險因素 單因素分析顯示，Snail（+）和Slug（+）患者的總生存時間短于Snail（-）和Slug（-）患者，KAI1（+）和E-cadherin（+）患者的總生存期長于KAI1（-）和E-cadherin（-）患者（P＜0.05）；多因素分析顯示，KAI1、Snail、Slug、E-cadherin、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期是影響鼻咽癌患者預后的獨立危險因素，見表3、表4。

表3 單因素分析影響鼻咽癌患者預后的危險因素（，個月）

表3 單因素分析影響鼻咽癌患者預后的危險因素（，個月）

表4 多因素分析影響鼻咽癌患者預后的危險因素

2.4 生存分析 Kaplan-Meier 生存分析顯示，KAI1 蛋白表達陽性患者的平均生存時間高于陰性患者（Log-rank=10.559）；Snail 表達陽性患者的平均生存時間短于Snail 表達陰性患者（Log-rank=13.343）；Slug 表達陽性患者的平均生存時間短于Slug 陰性患者（Log-rank=14.722）；E-cadherin 表達陽性患者的平均生存時間高于E-cadherin 陰性患者（Logrank=14.523），見圖2。

圖2 鼻咽癌患者的Kaplan-Meier 生存分析

3 討論

轉移是鼻咽癌患者預后不良的主要原因，發現特異性與穩定性較好的生物標志物來預測疾病的侵襲和轉移具有重要意義。本研究主要評估KAI1、Snail、Slug 和E-cadherin 在鼻咽癌中的表達及相關性，以期為確定鼻咽癌的預后和轉移提供新的方法。

既往研究表明[12-15]，KAI1 在胃癌、結直腸癌、前列腺癌等多種腫瘤中均能抑制腫瘤轉移。這些發現表明KAI1 可能是一個重要的生物標志物，可用于多種人類癌癥的轉移和預后。本研究發現，KAI1 的陽性表達在正常鼻咽上皮組織、鼻咽部黏膜炎組織、鼻咽癌組織中逐漸降低。此外，KAI1 的陽性表達與EB-DNA 水平、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期及鼻咽癌預后有關，提示KAI1 蛋白缺失可能參與鼻咽癌的發生、發展、侵襲和轉移。Kaplan-Meier 生存分析顯示，KAI1 蛋白表達陽性患者的生存時間高于陰性患者。

上皮間質轉化是指上皮細胞極性喪失，黏附減少或喪失，形態由圓形或長方體變為梭形，運動能力增強，容易脫離母細胞，引起浸潤和轉移。此外，上皮相關標志物表達減少或丟失，而間質相關標志物表達增強。近年來研究發現，大多數上皮性惡性腫瘤在侵襲轉移過程中可能伴有EMT。此外，最近的研究表明，Snail 蛋白的異常表達參與了腫瘤細胞的侵襲和轉移，其表達的增加可能提示預后不良。Snail 可由TGF-、EGF、Wnt、Notch 等多種刺激因子誘導。TGF-可調控PI3K/Akt 信號通路，PI3K/Akt 信號通路的激活是EMT 過程的核心信號。因此，PI3K/Akt 信號通路與TGF-可協同EMT 誘導過程。這些結果表明，Snail 與EMT 過程存在一定的關系[16-19]。本研究發現，鼻咽癌中Snail 蛋白陽性表達率高于鼻咽部黏膜炎組織和正常鼻咽上皮組織。此外，Snail蛋白陽性表達與EB-DNA 水平、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期及鼻咽癌預后有關，提示Snail 蛋白陽性表達的鼻咽癌細胞分化較差，易浸潤轉移，Snail 蛋白的陽性表達可能參與了鼻咽癌的發生、發展、侵襲和轉移。Kaplan-Meier 生存曲線顯示，Snail 表達陽性患者生存時間短于Snail 表達陰性患者，提示Snail 表達陽性患者預后較差。

Slug 和Snail 都屬于Snail 家族，都含有鋅指結構，鋅指結構是EMT 的關鍵調控因子，能夠抑制E-cadherin 的表達。Slug 在上皮惡性腫瘤中的表達增加通常表明EMT 和侵襲易感性。近期研究發現，Slug 蛋白在多種上皮性惡性腫瘤中均可異常表達，如頭頸部鱗狀細胞癌、子宮內膜癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等[20，21]。本研究發現，Slug 蛋白的陽性表達在鼻咽癌組高于鼻咽部黏膜炎組織和正常鼻咽上皮組織。Slug 蛋白的陽性表達率與EB-DNA 水平、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期及鼻咽癌的預后均相關。此外，Slug 蛋白陽性表達的患者生存時間短于陰性表達的患者。這些結果提示Slug 蛋白表達異常升高可能參與了鼻咽癌的發生、發展、浸潤和轉移。

E-cadherin 是EMT 過程中重要的上皮標志物。當E-cadherin 表達減少時，各上皮細胞的粘附減少，細胞形態由圓形或扁平變為紡錘形，運動能力增強，分化為間質細胞[22-24]。本研究發現，E-cadherin的陽性表達率在正常鼻咽上皮組織、鼻咽部黏膜炎組織、鼻咽癌組織中逐漸降低，E-cadherin 的陽性表達與上述相同的臨床特征均相關，提示E-cadherin 與KAI1 具有相同的作用。越來越多的研究表明，降低KAI1 的表達可抑制E-cadherin 的表達，從而降低E-cadherin/-catenin 復合物的穩定性，導致上皮性腫瘤的運動性增加，促進EMT 的發生，促進腫瘤的侵襲轉移。

在本研究中，Snail 和Slug 在正常鼻咽上皮組織中的表達較低，而在鼻咽部黏膜炎組織和鼻咽癌組織中表達逐漸升高。KAI1 和E-cadherin 在正常鼻咽組織中表達較高，在鼻咽部黏膜炎組織和鼻咽癌組織中表達逐漸降低。相關性分析發現，隨著鼻咽癌組織中KAI1 和E-cadherin 表達的降低，Snail和Slug 蛋白的表達增加，說明KAI1 和E-cadherin蛋白表達的減少或丟失與Snail 和Slug 表達的增加可能存在一定的相關性。本研究還發現KAI1 和E-cadherin 與Snail 和Slug 之間存在負相關，且多因素分析顯示KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 表達、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期是影響鼻咽癌患者預后的獨立危險因素。

綜上所述，Snail、Slug 和E-cadherin 是EMT 中關鍵的轉錄因子和生物標志物，可能參與了鼻咽癌的發生、發展、侵襲和轉移。當它們在鼻咽癌中表達異常時，KAI1 的表達降低或檢測不到，這可能進一步促進鼻咽癌的侵襲轉移。KAI1、Snail、Slug、Ecadherin 的表達與EB-DNA 水平、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期及鼻咽癌預后有關。因此，早期進行KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 的聯合檢測可預測鼻咽癌的侵襲轉移，也可作為預測鼻咽癌患者預后的有價值的指標。