氣相色譜法測定保健食品中肌醇含量的方法研究

劉文博

（山西省檢驗檢測中心 藥品檢驗技術研究所，山西太原 030031）

肌醇是微生物及動物生長的必要元素，可以從動物的心肌和肝臟中分離取得，主要以磷脂的形式存在，又稱肌醇磷脂[1]。肌醇可以代謝清除肝臟脂肪和膽固醇，預防動脈硬化，并且供給腦細胞營養，促進正常發絲的生長[2]。由于肌醇的食物營養強化作用，多應用于運動功能飲品、嬰幼兒配方食物等保健食品中，此外在發酵和食品工業中，肌醇可用于多種菌種的培養和促進酵母的增長等作用[3]。目前，肌醇的檢測范圍主要包括保健食品如功能性飲料及嬰兒配方奶粉等，檢測方法主要有微生物法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質譜法和毛細管電泳法等，各種檢測方法有各自的特點與不適用性[4]。本研究結合實驗室現有設備條件，對GB 5009.196—2003[5]中氣相色譜法測定保健食品中的肌醇含量進行方法學驗證，并探討了前處理過程中的關鍵點，旨在為今后相關部門開發出更為準確精密、檢測范圍更廣的實驗方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樂虎功能性保健飲料（達利食品集團有限公司）；國家藥品標準物質肌醇（純度為99.6%，中國食品藥品檢定研究院）；無水乙醇、正己烷、六甲基二硅氨烷、N,N-二甲基甲酰胺（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，天津市申泰化學試劑有限公司）；三甲基氯硅烷（化學純，國藥集團化學試劑有限公司）；實驗用水為一級超純水。

1.2 儀器與設備

GC-2010 氣相色譜儀（附氫火焰檢測器，日本島津公司）；XS 105 微量天平（精度0.000 01g，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200DE 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；EV311 旋轉蒸發儀（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；101-1A 電熱鼓風干燥箱（北京中興偉業儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑溶液制備

肌醇標準溶液：將肌醇標準物質于100 ℃的電熱鼓風干燥箱中干燥4 h，準確稱量0.052 05 g 于100 mL 容量瓶中，以70%乙醇溶液溶解并定容至刻度，配成0.520 5 mg/mL 肌醇溶液。

硅烷化試劑：分別量取一定量的三甲基氯硅烷、六甲基二硅氨烷、二甲基甲酰胺，以1 ∶2 ∶8 的體積比混合，現配現用。

1.3.2 供試品溶液制備

準確量取樂虎試樣2.0 mL 于三角瓶中，加入70%的乙醇溶液，使其含肌醇濃度為0.5 mg/mL，超聲波提取10 min 后，在3 000 r/min 的條件下離心5 min，取出上清液備用。

準確量取1.0 mL 試樣上清液于旋蒸瓶中，加入5 mL 無水乙醇，于60 ℃下旋蒸濃縮至近干，反復3 次，直至旋蒸瓶中液體完全除去。之后再向旋蒸瓶中加入5.0 mL 硅烷化試劑，使用超聲波提取器混勻瓶中內容物。再置于70 ℃水浴中加熱10 min，靜置待其冷卻后加入10 mL 純化水，再加入3.0 mL 正己烷，振搖1 min 后靜置10 min，在3 000 r/min 下離心5 min，以滴管取出正己烷層，加入少許無水硫酸鈉，小幅度振搖后放置，取上清液上機待測。

1.3.3 標準系列制備

分別吸取0.2 mL、0.4 mL、1.0 mL、2.0 mL 和4.0 mL 濃度為0.520 5 mg/mL 的肌醇標準溶液于5 個10 mL 容量瓶中，以70%乙醇溶液溶解并定容至刻度，配成濃度為0.010 41 mg/mL、0.020 82 mg/mL、0.052 10 mg/mL、0.104 10 mg/mL 和0.208 20 mg/mL的肌醇標準系列溶液。

準確量取1.0 mL 上述肌醇標準系列溶液于旋蒸瓶中，按1.3.2 中步驟操作，得到肌醇標準衍生溶液，上機待測。

1.3.4 氣相色譜條件

色 譜 柱：BP-5 毛 細 管 柱（25 m×0.32 mm，0.25 μm）；柱溫：恒溫190 ℃；進樣口溫度：245 ℃；進樣方式：分流進樣，分流比為1 ∶50；進樣量：1 μL；載氣：高純氮，流速為50 mL/min；檢測器：FID，空氣流量500 mL/min，氫氣流量40 mL/min，尾吹氣N2流量50 mL/min；色譜峰保留時間定性，峰面積外標法定量。

2 結果與分析

2.1 色譜分離分析

在1.3.4 色譜條件下，28 min 內能完成標準溶液與供試品溶液中肌醇的在線分析，標準溶液的色譜圖如圖1，肌醇色譜峰尖銳對稱，與溶劑峰、雜質峰能較好地分離，可以準確地進行分析檢測。

圖1 肌醇標準溶液色譜圖

2.2 前處理條件探討

2.2.1 水分對實驗的影響

向兩份樂虎飲料中添加相同含量的肌醇標準溶液，其中一份在旋蒸過程中水分揮發不完全，另一份完全蒸干水分，測定比較兩者的回收率，考察實驗中水分的完全除去與否對測定結果的影響。結果顯示，旋轉蒸發過程中水分未完全揮發的回收率為84.5%，水分揮發完全的回收率為100.1%，表明前處理中水分的完全除去與否對實驗回收率影響較大。原因可能是當旋蒸過程中水分揮發不完全，部分肌醇溶于水中未被提取出來，因此實驗過程中應確保烘干水分，可在旋轉蒸發后再將三角瓶放入烘箱中在75 ℃下烘干1 ～2 h，確保試樣中不含水分。

2.2.2 乙醇濃度對實驗的影響

向兩份樂虎飲料中添加相同含量的肌醇標準溶液，其中一份在旋轉蒸發時使用無水乙醇，另一份使用95%乙醇，測定比較兩者的回收率，考察實驗中乙醇濃度對測定結果的影響。結果顯示，旋蒸過程中使用無水乙醇時回收率為102.6%，使用95%乙醇時回收率為99.6%，均在國家標準GB/T 27404—2008[6]要求的95%～105%范圍內，表明旋轉蒸發過程中所用乙醇的濃度對實驗結果影響并不大。

2.3 線性關系與檢出限

將肌醇標準系列溶液分別進樣于氣相色譜儀中，測定相對應的峰面積，以峰面積為y軸，以進樣濃度為x軸，繪制標準曲線，計算出線性回歸方程為y=1 615 898x-2 159，相關系數r=1，表明肌醇在0.010 41 ～0.208 2 mg/mL 呈現良好線性關系。吸取0.01 mL 2.2.2 中的樂虎飲料加標溶液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，以氣相色譜進樣量5 μL作為檢測限，進樣量10 μL 作為定量限，測得該方法的檢出限為0.20 μg/mL，定量限為0.98 μg/mL。

2.4 加標回收率與重復性

準確稱取18 份0.25 g 的樂虎飲料試樣（經本方法測得肌醇本底含量為0.098 mg）平均分為3 份，按照低、中、高3 種濃度水平分別加入0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 濃度為0.8 μg/mL 的肌醇標準中間液，按照1.3 實驗方法將每種濃度水平進行6 平行測試，計算方法的回收率與重復性RSD，結果見表1。樂虎飲料試樣中肌醇在0.083 3 ～0.124 9 mg 添加水平下，回收率在96.0%～104.7%，重復性RSD為1.37%～2.67%，表明本方法準確度與重復性較好。

表1 肌醇的加標回收率與重復性實驗結果

2.5 方法的穩定性考察

將濃度為53.865 ng/mL 的肌醇標準衍生溶液分別于0 h、2 h、6 h、12 h、24 h 和36 h 時按照1.3.4色譜條件進行在線分析，考察方法的穩定性，測得峰面積（uV·min）分別為10 905、10 728、11 221、11 256、11 329 和11 533，計算相對標準偏差為2.63%，表明肌醇衍生待測液在36 h 內基本穩定，可以滿足多批次處理、儀器連續進樣的需求。

3 結論

本研究對國家標準GB 5009.196—2003 中肌醇含量的測定方法進行了驗證，并探討了旋轉蒸發過程中水分揮發程度及乙醇濃度對實驗結果的影響。結果表明，旋蒸過程中水分必須完全除去，而乙醇濃度對實驗結果影響不大。通過對方法的線性關系、檢出限、定量限、加標回收率、重復性及穩定性進行考察，該方法符合GB 5009.196—2003 與GB/T 27404—2008 中的相關要求，可以滿足當前食品檢測實驗室高通量、快速、準確的檢測需求。