液相色譜-質(zhì)譜法測定豬肉中禁用獸藥五氯酚酸鈉測量不確定度評定

楊 柳，許瑞清，崔小芳，劉建春

（1.山西省檢驗(yàn)檢測中心，山西太原 030032；2.山西錦爍生物醫(yī)藥科技有限公司，山西晉中 030600）

五氯酚酸鈉即五氯酚鈉，可用作落葉樹休眠期噴射劑，以防治褐腐病，也用作除草或殺蟲劑[1]。中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250 號公告將五氯酚酸鈉列入食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo U3000-AB seicx 4500Qtrap 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；P-SAX 固相萃取柱（60 mg/3 mL），月旭科技(上海)股份有限公司；UW620H 電子天平，日本島津公司。

五氯酚酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL，由壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供）；乙腈、甲醇均為質(zhì)譜級。

采用GB 23200.92—2016[2]進(jìn)行測量。由同一檢驗(yàn)員在相近的時間內(nèi)，對同一份豬肉樣品測定10 次，對測量結(jié)果評定測量不確定度。

1.2 檢測方法

稱取均質(zhì)試樣2 g，置于10 mL 聚丙烯離心管中，加入6 mL 5%三乙胺的乙腈-水溶液，均質(zhì)提取2 min。3 000 r/min 離心5 min，收集上清液于離心管中。重復(fù)上述提取步驟1 次，合并上清液，混勻。將提取溶液轉(zhuǎn)入經(jīng)過預(yù)處理的MAX 固相萃取柱中，1 滴/s 流速使樣液全部通過固相萃取柱，棄去流出液。依次用5 mL 5%氨水溶液、5 mL 甲醇、5 mL 2%甲酸的甲醇-水溶液淋洗，棄去流出液，抽干固相萃取柱5 min 以上。以4 mL 4%甲酸甲醇溶液洗脫，洗脫液收集于10 mL 具刻度試管，40 ℃水浴下氮吹至1 mL，用水定容至2 mL，混勻。過0.22 μm 濾膜，供測定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

采用吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL 定容至10 mL 容量瓶中的方法，2 級稀釋配制成10 ng/mL 的五氯酚酸鈉中間使用液，依次吸取相應(yīng)體積置于10 mL容量瓶中，用基質(zhì)液定容，配成0 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL 和5.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作系列。

1.4 儀器條件

（1）色譜條件。SHISEIDO CAPCELL PAK MG III C18（150 mm×2.0 mm，5μm）色譜柱；流動相：甲醇+5 mmol/L 乙酸銨溶液（60+40），等度洗脫；流速：300 μL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

（2）質(zhì)譜條件。離子化模式：電噴霧電離負(fù)離子模式（ESI-）；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；定量離子對：262.7 ＞262.7，定性離子對：264.7 ＞264.7、266.7 ＞266.7、268.7 ＞268.7。

1.5 測量過程

用液相色譜質(zhì)譜儀測定工作標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的峰面積，制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。待測樣液注入儀器測定，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量，得出樣液濃度。

2 測量結(jié)果分析

2.1 建立測量數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測量過程建立測量數(shù)學(xué)模型：

式中：xi為試樣中待測物含量，μg/kg；ci為樣液中待測物的濃度，ng/mL；V為試樣經(jīng)處理后定容體積，mL；m1為試樣的質(zhì)量，g。

2.2 重復(fù)性測量結(jié)果

在相近的時間內(nèi)，由同一操作人員對樣品測量，10 次 測 定 結(jié) 果 分 別 為0.210 μg/kg、0.188 μg/kg、0.186 μg/kg、0.200 μg/kg、0.203 μg/kg、0.199 μg/kg、0.190 μg/kg、0.208 μg/kg、0.203 μg/kg 和0.184 μg/kg，平均值x—=0.197 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.009 39。

3 測量不確定度評定

3.1 測量重復(fù)性引入的測量不確定分量

3.2 工作曲線變動性的不確定度分量

標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液分別進(jìn)行3 次重復(fù)測定，數(shù)據(jù)處理見表1。

根據(jù)表1 中的測試數(shù)據(jù)，用最小二乘法擬合線性回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程：y=356 880x+44 868，b=356 880，a=44 868，R=0.998 5。由工作曲線變動性引起被測量溶液濃度標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測量參數(shù)

式中：n為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測量次數(shù)，n=18；P為樣品溶液測量次數(shù)為工作曲線各校準(zhǔn)濃度的平均值

被測樣品平均含量為0.197 μg/kg，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線待測物濃度為則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(c)1=0.961，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度的不確定度分量

五氯酚酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書（編號91098b，唯一標(biāo)識21090491）給出相對擴(kuò)展不確定度為U=kurel(c)=0.02（k=2），因此urel(c)2=0.01。

3.4 定容體積引起的不確定度分量

10 mL 離心管定容至2 mL，依據(jù)JJG 10—2005[3]其允許誤差為±0.2 mL，其允差不確定度按均勻分布計算為不考慮過程中由溫差引起的不確定度。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(V)=0.115，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.5 取樣量引入的不確定度分量

3.6 合成不確定度

上述各分量互不相關(guān)，按照不確定度傳播率公式計算相對合成不確定度

標(biāo) 準(zhǔn) 合 成 不 確 定 度 為u(x—) =0.197×0.665=0.131 μg/kg。

3.7 擴(kuò)展不確定度

取95%置信概率，包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=ku=2×0.147=0.262 μg/kg。

4 測量不確定度報告

用液相質(zhì)譜法測定豬肉試樣中五氯酚酸鈉測量不確定度報告為x=0.197[-0.065,0.459] μg/kg，k=2。采用經(jīng)典方法調(diào)整，用液相質(zhì)譜法測定豬肉試樣中五氯酚酸鈉測量不確定度報告為x=0.197[0,0.491] μg/kg，k=2。

5 結(jié)論與討論

禁用藥物是常見食品檢測項(xiàng)目，其測量值低，接近于零，即使為負(fù)數(shù)也是合理的，可以按照GUM 法對測量不確定度進(jìn)行評定，報告時對報告值加以修正，本研究采用經(jīng)典方法加以修正[3-4]。

5.1 經(jīng)典方法確定擴(kuò)展不確定度區(qū)間

經(jīng)典方法直接將擴(kuò)展不確定度區(qū)間從零開始調(diào)整，這樣測量不確定度則為不對稱區(qū)間，如圖1 中（d）[5]。測量值低于0 時，將測量值與測量區(qū)間同時調(diào)整，如圖1 中（b）（c）。圖1 中（a）則調(diào)整為0[0,0]，k=2。

圖1 經(jīng)典方法接近于零的擴(kuò)展不確定度區(qū)間情況

5.2 各分量測量不確定度分析

評定中各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量說明：A 類評定為測量重復(fù)性、工作曲線變動性；B 類評定為標(biāo)準(zhǔn)儲備液、定容體積和取樣量。本研究所建立的測量評定方法，工作曲線變動性引入測量不確定度貢獻(xiàn)最大，貢獻(xiàn)率為88.88%。