黃酒中菌落總數測定不確定度評定

相露婷，傅華靖，王佳麗，劉 鎮

（紹興市食品藥品檢驗研究院，浙江紹興 312000）

菌落總數是食品檢驗較為常見的檢測項目。在實際檢測中，樣品中菌種總數的檢測結果往往發散較大，而影響檢測結果的因素也很復雜。因此，每個實驗室都會對本實驗室的菌落總數計數的能力進行考核驗證。黃酒作為地理標志產品，其檢測過程中對菌落總數并沒有作出明確的規定，但微生物污染對于黃酒的生產和保存是非常關鍵的因素，在生產加工過程中對菌落總數的監測是必不可少的項目。因此，對菌落總數的檢測不確定度評定是必不可少的。由于黃酒本身的特殊性質，其中含有的乙醇可能對菌落產生一定的抑制作用，從而影響菌落計數結果，所以此次對黃酒中菌落計數的不確定度進行評定非常重要且具有實際參考意義。

本次研究應用平板菌落計數法測量黃酒中的菌落總數，通過對影響測量結果的不確定度分量的分析和量化，求出被測定菌落總數的標準不確定度和擴展不確定度，并對測量結果進行表述。鑒于檢測過程中黃酒本身含菌量較少，在實際實驗樣品中加入少于100 CFU 標準菌株作為污染菌，以便統計和分析研究。因此，在測定不確定度之前，還需測定該黃酒對不同菌種的抑制情況，從中選擇影響較小的菌種進行不確定度評定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本次研究采用樣品為市面上較為常見的傳統型黃酒，酒精度為11.0%vol，酒齡3 年。菌種為大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC6538、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028。營養肉湯培養基，生產廠家為青島海博，批號20190531；平板計數瓊脂，生產廠家為青島海博，批號20200504；氯化鈉，生產廠家為國藥化工，批號20191106。

1.2 儀器與設備

JJ2000B 型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；ESCO class Ⅱ型生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；MLS-3780 型高壓蒸氣滅菌器，日本三洋公司；HPP260 型生化培養箱，德國memmert 公司；BGZ-240 型電熱鼓風干燥箱，上海博迅。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌液計數

取標準菌株大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌于營養肉湯培養基36 ℃培養24 h，將菌液制成10 倍系列稀釋液，吸取1 mL 稀釋液，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1 mL 稀釋液加入2 個無菌平皿中，作為空白對照。使用平板計數（Plate Count Agar，PCA）培養基注皿。于36 ℃培養48 h，計數。上述菌液2 ℃冰箱冷藏保存，以保證菌液濃度維持在此水平。

1.3.2 回收率測定

選取菌落數量在500 ～1 000 CFU/mL 稀釋度菌液，分別加入10 mL 黃酒中，混勻后按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》（GB 4789.2—2016）[1]方法計數。同時以加入10 mL生理鹽水作為對照組進行計數。培養基為平板計數瓊脂，36 ℃培養48 h。

1.3.3 黃酒中菌落總數測定

根據回收率測定結果，選擇回收率較高的菌液來污染黃酒菌株。將同一份黃酒樣品分成11 份，每份50 mL，取稀釋度適宜的菌液1 mL 加入每份樣品中作為污染的黃酒樣品。按照標準GB 4789.2—2016[1]方法，無菌環境下量取樣品25 mL，置于盛有225 mL 無菌生理鹽水的滅菌杯內，混勻，制成1 ∶10供試液。取上述供試液1 mL，沿管壁緩慢注于9 mL無菌生理鹽水的試管中，混勻，制成1 ∶100 供試液。選擇1 ∶10、1 ∶100 兩個稀釋度進行計數。取1 mL 樣品勻液于無菌平皿中，每個稀釋度做2 個平皿。同時，分別吸取1 mL 稀釋液加入2 個無菌平皿中，作為空白對照。使用平板計數（Plate Count Agar，PCA）培養基注皿。于36 ℃培養48 h，計數，11 組菌落總數計數取稀釋度為100的計數結果。

2 結果與分析

2.1 菌液計數結果

結果得到3 種菌液的濃度分別為大腸埃希氏8.3×108CFU/mL、金黃色葡萄球菌7.1×107CFU/mL、鼠傷寒沙門氏菌5.5×108CFU/mL，詳見表1。

表1 菌液計數結果（單位：CFU/mL）

2.2 回收率測定結果

根據表2 的結果，可以看出，該黃酒樣品對本次實驗使用的3 種菌的抑菌作用基本都不大，但相較于金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌，對大腸埃希氏菌的回收率影響更小，所以在之后的不確定度評定實驗中選擇大腸埃希氏菌作為本次評定的污染菌株進行研究。

表2 回收率測定結果（單位：CFU/mL）

2.3 黃酒菌落總數計數結果

11 份大腸埃希菌污染黃酒樣品分析數據見表3。

表3 11 組平行樣測定結果（單位：CFU/mL）

3 不確定度評定

3.1 不確定度來源分析

在日常檢驗過程中影響菌落總數的檢測結果的因素有很多，如檢驗人員、環境、時間、操作等都能對檢驗結果構成不同程度的影響。根據實際情況進行分析，將不確定度的來源分成系統誤差（A 類）和隨機誤差（B 類）。A 類主要包括樣品處理（稀釋、稱量、均勻度等）和儀器設備（移液器、培養箱、電子天平等），B 類主要包括重復測定過程中的測試環境、操作人員、培養條件（包括培養基、培養溫度）等。而微生物學科屬于非嚴格性、非度量學一類，A 類不確定度對合成不確定度貢獻較小，重復測量帶來的不確定度占主要部分[2]。因此，本次不確定度評定只考慮其重復性產生的不確定度，即對B 類誤差的不確定度進行評定。

3.2 不確定度計算

3.2.1 實驗重復性引入的不確定度

對11 份黃酒樣品按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》 （GB 4789.2—2016）進行檢測，得到數據見表3。由于實際數據相差較大，按照取對數值的方式進行數據處理后再進行統計，結果見表3。

根據表3 數據，再利用貝塞爾公式，計算出樣品標準差[3-5]：

得到不確定度為：

3.2.2 擴展不確定度

取 置 信 水 平95%，v=11， 查t分 布 表，得k=t95(11)=2.201。故擴展不確定度U=kUc=2.201×0.059 3=0.130。

4 結論與討論

當檢驗記錄以11 次檢驗對數值的平均值表示時，其取值區間分布于-0.130 ～0.130，其對數值再取反對數，得取值區間分布。樣品菌落總數lgx=lgX±0.130）。11 個樣品檢驗結果平均值為26 CFU/mL，為1.398 84，該樣品的菌落總數的lgx值為1.399±0.130，分布于1.269 ～1.529，取反對數，其結果分布于18.578 ～33.806 CFU/mL，即第11 個樣品菌落總數的檢驗結果可估算為18 ～34 CFU/mL。

本次實驗是按照食品微生物學檢驗標準來設計完成，符合國家標準要求對黃酒的檢驗方法。此次研究根據不同菌種在黃酒中的回收率選出受黃酒影響較小的菌株加入本身含菌量較少的黃酒中，從而模擬最可能的實際生產情況，提高了本次不確定度評定的可靠性。黃酒產品的日常檢驗中雖然沒有特別針對菌落總數的限量要求，但是其生產過程有大量微生物繁殖，所以菌落總數是其出廠檢驗的常規項目。很多酒廠都有自己的微生物分析實驗室，在進行菌落總數的不確定度評定時可以參考此法。此法也可用于對其他不同品類的樣品進行不確定度評定，從而確保實驗室檢測結果的準確性和可靠性。