一株產纖維素酶細菌B4的鑒定及發酵條件優化

楊艷紅，劉 旸，張浩鉑，姚心怡，賀 禧

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054； 2.重慶市育才中學, 重慶 400050)

0 引言

纖維素生物質是地球上分布最廣泛、含量最豐富的碳水化合物，約占全球總可用生物量的50%，主要由纖維素(30%～50%)、半纖維素 (20%～30%)、木質素(15%～30%)組成[1-3]。但纖維素、半纖維素和木質素是緊密結合的、通過氫與共價鍵的復接，使其成為頑固性的生物質結構，所以纖維素生物質也是應用效率最低的一種自然物質[4-5]，在實際應用中，僅開發了不到2%的纖維素資源[6]。隨著人類世界迅猛發展，能源需求量急劇上升，為實現可持續發展，世界各國均在努力尋求新的替代能源，如風能、核能、太陽能、生物質能等。在各種新型的替代能源中，纖維素燃料乙醇是公認的最具有發展前景的可再生能源。利用現代生物技術將纖維素轉化為乙醇等液體燃料，產量穩定、可再生、無污染，有希望解決能源危機、環境污染和糧食危機等問題[7]。雖然科學家們現在已經做了大量的木質纖維素的轉化研究，但是由于半纖維素酶和纖維素酶的成本問題，把纖維素生物質轉化成生物乙醇仍面臨巨大挑戰[8]。目前，生物燃料乙醇生產高度依賴于商業生產的酶，成本非常高[9-10]。因此，開發新型、高效、低成本的纖維素酶迫在眉睫，選育纖維素酶高產菌株尤其重要[11-12]。本課題組從重慶市周邊堆肥中篩選出一株纖維素酶高產細菌菌株，對其進行鑒定和發酵條件研究，可為纖維素酶制劑研究提供菌株來源和為遺傳改良、基因工程菌株的構建等工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株

B4 ，重慶理工大學生物工程實驗室分離。

1.1.2試劑

葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸等常規試劑均為國產分析純；溶菌酶、細菌基因組總DNA 提取試劑盒、細菌鑒定試劑盒、PCR 產物回收試劑盒均購于北京擎科生物科技有限公司成都分公司。

1.1.3培養基

肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏0.3 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，水100 mL，pH 7.0。

菌種鑒定培養基：參見《常見細菌系統鑒定手冊》[7]。

固體發酵培養基：(NH4)2SO40.5 g，蛋白胨0.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.075 g，糖蜜0.5 g，CaCl20.5 g，NaCl 0.5 g，纖維素粉20 g，麩皮30 g，水125 mL。

1.2 方法

1.2.1菌株形態及菌落形態觀察

將B4菌株劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養基平板，30 ℃下培養1～2 d，觀察菌落形態。挑取菌落抹片，然后分別進行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色和鞭毛染色，鏡檢，觀察分離菌株菌體形態與其他特征。

1.2.2生理生化特征和生理耐受特性

參照文獻《常見細菌系統鑒定手冊》[13]和《現代微生物學實驗技術》[14]進行。

1.2.316S rDNA序列測定

把B4菌株培養至對數期，嚴格按照植物 DNA 提取試劑盒(通用型)操作說明進行操作，獲得基因組DNA，提取的 DNA 樣品適量稀釋后作為 PCR 模板，以擎科 1×TSE101 金牌 mix 進行PCR反應，PCR產物用擎科DNA 凝膠回收試劑盒進行回收純化。純化產物送北京擎科生物科技有限公司成都分公司測序部進行全序列測序。將序列通過NCBI網站中的BLAST程序與GenBank中的核酸數據進行對比分析。根據比對結果，從數據庫中選取與所分析的細菌基因序列同源性較高的已知相關序列，采用MEGA 11.0軟件進行多重序列比對分析，用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構建系統發育樹，用Bootstrap檢驗，Bootstrap值為1 000。

1.2.4發酵培養基篩選

1) 酶活力定義：以濾紙為底物，在一定反應條件(pH 5.6，50 ℃，恒溫30 min)下，以水解反應中，1 g發酵固體產生的纖維素酶1 min催化纖維素生成1 μg葡萄糖為1個濾紙酶活單位，以U表示。

2) 濾紙酶活力測定方法：采用DNS法[14]。

3) 先采用單因素預實驗確定最佳纖維素粉為玉米芯粉，最佳遲效氮源蛋白胨和麩皮。在初篩的基礎上對培養基的主要成分進行13因素3水平的正交實驗優選，固體發酵培養從第1 d開始取樣，直到測定濾紙酶活下降為止，以最高濾紙酶活為指標進行統計分析，因素水平排布見表1。

表1 培養基成分正交設計因素水平排布

1.2.5理化因素發酵條件篩選

先經單因素預實驗分別確定初步的發酵條件為pH 6.5，溫度35 ℃。然后以pH、溫度和接種量為考察因素進一步正交優化，固體發酵培養從第1 d開始取樣，直到測定濾紙酶活下降為止，以最高濾紙酶活為指標進行統計分析，正交實驗因素水平排布見表2。

表2 理化條件篩選因素水平排布

2 結果與分析

2.1 菌落形態及個體形態

B4菌株菌落均呈圓形，乳白色，表面干燥，中心隆起，邊緣不規則，呈鋸齒狀。菌體革蘭氏染色為陽性，長桿狀，芽孢橢圓中生，形態特征見圖1。

圖1 B4菌株形態特征示意圖

2.2 生理生化特征和生理耐受特性

B4菌的生理生化試驗結果見表3：除了運動性、V-P、吲哚試驗呈陰性外，其余的甲基紅、纖維素水解、淀粉水解、硝酸鹽還原、尿素分解、過氧化氫酶、明膠液化試驗均呈陽性；糖類利用試驗結果表明B4菌對測試9種糖均可利用，對于五碳糖阿拉伯糖的利用效果最好，其次是葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的利用效果好。生理耐受特性試驗結果見表4， B4菌能在25～45 ℃生長，25～37 ℃生長較旺盛，最適的生長溫度為25 ℃；B4菌耐受NaCl最大濃度為8%；能在pH為5.0～8.0生長，最適pH值為8.0。綜合供試菌株B4的形態特征及生理生化特性及生理耐受特性，《常見細菌系統鑒定手冊》中相應屬、種的有關性狀，可將B4菌歸入芽孢桿菌屬(Bacillus)。

表3 菌株B4生理生化特征

表4 B4菌的生理耐受性特性

續表(表4)

2.3 16S rDNA 序列和系統發育分析

B4的16S rDNA的基因全序列長度為1 449 bp，在GenBank中的登錄號為：OM755768。將獲得的基因序列在GenBank數據庫中進行Blast同源性比對分析，結果表明，B4的16S rDNA序列與許多Bacillusamyloliquefaciens相似性均為99.5%以上。從中選取部分同源性較高的菌種，用MEGA11.0構建的系統發育樹分析，如圖2所示，發現B4與BacillusamyloliquefaciensstrainW9和SXAU001聚在一個進化分支上。

綜合上述B4菌株的形態、生理生化特征，以及16S rDNA的系統發育樹的分析，確定B4菌株為芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

注：步長值為1 000 ，節點上的頻率大于50的保留，括號中的數字表示序列在GenBank中的登錄號， 0.5%為遺傳標尺

2.4 固體發酵培養基篩選

培養基篩選的正交試驗結果如表5所示。由極差值R可以得出各因素對菌株B4產酶活力的影響程度由大到小依次為：玉米芯粉> MgSO4·7H2O>CaCl2>土溫20>麩皮>蛋白胨>(NH4)2SO4>NaCl>水>土溫80。由正交分析可得出B4菌的固體發酵培養基的最佳配比為：通過直觀分析得出綜合的優方案為：玉米芯粉 25 g、七水硫酸鎂 0.075 g、氯化鈣 0.2 g、土溫20 0.4 g、麩皮 8 g、蛋白胨 0.5 g、硫酸銨 0.2 g、氯化鈉 0.2 g、水 120 mL、土溫80 0.2 g、磷酸二氫鉀 0.5 g、糖蜜 0.5 g。

表5 發酵培養基成分正交實驗結果

續表(表5)

根據表6方差分析進行因素顯著性判斷，可見玉米芯粉和七水硫酸鎂對濾紙酶活有非常顯著的影響，氯化鈣和土溫20對濾紙酶活有顯著影響。而七水硫酸鎂的優化結果正好處于中間水平值，不需再篩選。又因玉米芯粉、氯化鈣及土溫20在正交優化結果中處于邊緣水平值，因此，在保持其他成分按正交優化的結果外，玉米芯粉、氯化鈣及土溫20這3個因素需要另設水平進行4因素3水平正交優化，正交排布表和結果分別見表7、8。

表6 發酵培養基成分正交實驗方差分析

續表(表6)

表7 培養基成分復篩正交排布

通過復篩結果表8可以得出綜合的優方案為：玉米芯粉 25 g、七水硫酸鎂 0.075 g、氯化鈣 0.1 g。綜合第1次正交優化結果，最終確定B4發酵纖維素酶的最佳固體發酵培養基為：玉米芯粉 25 g、七水硫酸鎂 0.1 g、氯化鈣 0.1 g、土溫20 0.6 g、麩皮 8 g、蛋白胨 0.5 g、硫酸銨 0.2 g、氯化鈉 0.6 g、土溫80 0.2 g、磷酸二氫鉀 0.5 g、糖蜜0.5 g、水 125 mL。

表8 培養基成分復篩試驗結果

2.5 理化因素發酵篩選

發酵理化條件篩選采用正交試驗，結果見表9，由極差值R可以得出各因素對產酶活力影響由大到小依次為：溫度>pH>接種量。同時，正交分析得出B4菌的固體發酵條件為：溫度34 °C，pH 6.0，接種量1.5%(OD600=1.0)。

表9 理化條件篩選結果

B4菌在上述確定的最佳培養基和最佳理化條件下進行發酵，取不同發酵時間的樣品進行濾紙酶活測定，做出發酵時間和酶活的變化曲線，確定最佳發酵時間，結果如圖3所示，在前12 h內濾紙酶活隨著發酵時間呈直線上升，12～24 h，濾紙酶活增加緩慢，直到24 h到達18.74 U/g，24 h以后，濾紙酶活迅速下降。

圖3 酶活隨發酵時間的變化曲線

3 討論

纖維素酶(cellulose)是降解纖維素生成單糖或多糖的一組酶的總稱。纖維素酶由多組復合酶系組成，主要包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1、4葡萄糖苷酶， 3種酶相互協同降解纖維素物質[15]。濾紙是聚合度和結晶度都居“中等”的纖維性材料，以其為底物經纖維素酶水解后生成還原糖的量來表征纖維素酶系總的糖化能力的方法得到廣泛應用，它反映了三類酶組分的協同作用，統稱濾紙酶活，濾紙酶活力可代表纖維素酶的總體酶活力，即纖維素內切酶水解纖維素聚合鏈，將其還原性和非還原性末端暴露在外；外切葡聚糖酶則作用于這些末端，釋放纖維二糖或纖維寡糖；β-葡聚糖苷酶的作用則是水解纖維二糖，3個酶組分相互協同作用，釋放最終的水解產物葡萄糖[16-17]。本文在篩選B4菌株固體發酵條件時以濾紙酶活為測定指標，該指標是菌株B4整個纖維素酶系的酶活力水平的綜合體現，代表了纖維素酶的3種酶組分協同作用后的總酶活。以該指標篩選出來的發酵條件對菌株的實際開發應用更有參考價值。

目前對纖維素酶產生菌的研究主要集中在真菌，如木霉屬、青霉屬和曲霉屬等，而其纖維素酶多數結合在細胞膜上，菌體細胞需吸附在纖維素上才能起作用，使用很不方便，且酶的分離提取成本太高[18]，并且這些真菌生產纖維素酶不僅生產周期長，產生的纖維素酶大多需要在較高溫度條件下才能發揮較好的效能，在室溫或較低溫度下，它們的酶活力都非常低。而細菌產生的纖維素酶以多酶復合體的形式存在，能夠更加徹底、更加有效地降解纖維素[19]。近 20 年來，隨著中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉紡織品的水洗工藝和洗滌劑中的成功應用，細菌纖維素酶的酶制劑也顯示出良好的應用前景[20]。

4 結論

本文篩選的B4菌株是一種解淀粉芽孢桿菌，是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，在自然界分布廣泛，易分離培養，對人畜無毒無害，不污染環境，具有很好的應用前景。另外，該菌株最適生長溫度為25 ℃，在篩選的最適培養基和最適條件下，固體發酵24 h就能獲得較高濾紙酶活力，相對于普通真菌產酶周期一般幾天至一個月來說，發酵周期大大縮短，并且酶系組分較全，具有很好的開發潛力。