膽石癥患者血清膽汁酸譜的檢測與分析

金素麗 武 艷 汪 冉 楊 利 閆國超 趙 帥

1.河北醫科大學第一醫院檢驗中心，河北石家莊 050000；2.河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北石家莊 050000

膽石癥是臨床上常見的一種疾病，根據結石的發生部位可分為膽囊結石、膽總管結石和肝內膽管結石，其中膽囊結石和膽總管結石較為常見[1]。我國膽囊結石患病率為2.3%～6.5%[2]，個別地區的發病率較高，甚至可達24.0%[3]，且隨著人口年齡的增長和人們生活水平的提高，其患病率呈上升趨勢[4-7]。研究表明，很多因素可以促進膽石的形成，如：遺傳因素、環境、性別、脂質代謝異常、膽囊功能、促核因子、生活習慣、其他疾病影響等[8]，這些危險因素可以通過影響膽汁代謝導致膽汁成分改變或影響膽囊功能而誘發膽囊結石[9-10]。雖然，目前對膽石癥形成的大致危險因素已有所認識，但仍缺乏有效的策略以預防膽石的形成[11]。膽汁酸是膽結石發病的重要因子，人體血清中膽汁酸各亞組分的比例、含量的變化，與膽石癥的發病及轉歸關系密切，臨床上常用熊脫氧膽酸作為膽結石的治療藥物[2]。因此，膽汁酸譜的檢測可能對膽石癥的診斷及預防有一定的價值。以往由于技術的限制，臨床上主要測定總膽汁酸的含量，不能定量檢測血清中各膽汁酸代謝組分的含量。隨著高效液相色譜串聯質譜（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術的發展，膽汁酸代謝譜的檢測在臨床上的應用日漸成熟，利用其高靈敏性、高特異性、高通量的特點檢測血清中膽汁酸亞組分的含量可為篩選膽石癥轉化標志物提供一種新思路。本研究通過對膽石癥患者血清中膽汁酸譜的檢測，探索其在膽石癥的臨床診斷及早期預防中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019 年9 月至2020 年6 月在河北醫科大學第一醫院（以下簡稱“我院”）確診為膽囊結石或膽管結石的患者59 例作為研究對象。其中膽囊結石組48 例，其中男16 例，女32 例；年齡27～75 歲，平均（54.08±12.68）歲；膽管結石組11 例，其中男2 例，女9 例；年齡32～73 歲，平均（58.36±14.61）歲。納入標準：①經超聲、CT 或磁共振膽胰管成像診斷確診為膽囊結石或膽管結石；②同意血清膽汁酸譜檢測。排除標準：①有病毒性肝炎、酒精性肝病等肝臟損傷的病史；②有梗阻性腸道疾病。對照組來自同期我院體檢中心經彩超確認無膽囊結石或膽管結石的健康體檢者，共26 例，其中男10 例，女16 例；年齡32～76 歲，平均（48.35 ±11.33）歲。三組一般資料比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。該研究經我院倫理委員會審批同意，所有受試者知曉并簽署知情同意書。

1.2 儀器及試劑

Waters ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD（美國，Waters 公司）；H1650R 臺式高速冷凍離心機（中國，上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；G560E 渦旋混合器（美國，Scientific Industries 公司）；CV100-DNA-H 真空離心濃縮儀（中國，北京乾明基因技術有限公司）；色譜柱為Waters 公司UPLCBEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

HPLC-MS 級甲醇、甲酸、乙腈購自美國Fisher Scientific 公司；釋放劑及內標液購自杭州佰辰公司，所有實驗用水均為蒸餾水。

1.3 樣本的采集及預處理

樣本采集：膽囊結石組（術前）、膽管結石組（術前）及對照組于清晨空腹采集靜脈血5 ml 并以離心力1760 g 離心10 min，提取上清液保存于-80 ℃冰箱待測。

預處理：取100 μl 血清樣本，加入300 μl 膽汁酸內標工作液，旋渦混合5 min，離心力13 813 g，4℃低溫離心5 min，吸取上清液300 μl，低溫濃縮2 h 至近干；用100 μl 的樣本釋放劑B 液復溶，旋渦混合5 min，離心力13 813 g，4℃低溫離心5 min，取上清液80 μl于96 孔板中，采用LC-MS/MS 對膽汁酸進行分析。

1.4 UPLC-MS/MS 分析

采用線性梯度洗脫模式對膽汁酸進行色譜分離，流速為0.4 ml/min，柱溫為45℃。流動相A：10%（體積比）的甲酸水溶液；流動相B：乙腈∶甲醇為3∶1 的混合溶劑。梯度分離條件為：0～0.5 min，38%B；0.5～1.9 min，38%B →48%B；1.9～6.7 min，48%B →64%B；6.7～8.7 min，64%B→83%B；8.7～10.7 min，83%B→95%B；10.7～11.3 min，95%B→38%B；11.3～12.0 min，38%B。進樣量為5 μl。

質譜儀離子化方式：電噴霧離子源，負離子模式。采用多反應監測模式對膽汁酸譜進行定量檢測。15 種膽汁酸亞組分分別為：膽酸（choleic acid，CA）、鵝脫氧膽酸（chenodesoxycholic acid，CDCA）、脫氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）、石膽酸（lithocholic acid，LCA）、甘氨膽酸（glycocholic acid，GCA）、甘氨熊脫氧膽酸（glycoursodeoxycholic acid，GUDCA）、甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA）、甘氨脫氧膽酸（glycodeoxycholic acid，GDCA）、牛磺膽酸（taurocholic acid，TCA）、牛磺脫氧膽酸（taurodeoxycholicacid，TDCA）、牛磺熊脫氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）、牛磺鵝脫氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）、牛磺石膽酸（taurolithocholic acid，TLCA）、甘氨石膽酸（glycocholic acid，GLCA）、熊脫氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對所得數據進行統計學分析，正態分布計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，偏態分布計量資料的描述以中位數（四分位數）[M（P25，P75）]表示，多組間比較采用獨立樣本的Kruskal Wallis 檢驗。計數資料采用例數表示，比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

三組TLCA、GLCA 大部分數據小于檢測限，故未進行比較統計。三組GCA、GUDCA、GCDCA、TCA、TUDCA、TCDCA 這6 種膽汁酸亞組分比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）；兩兩比較發現，膽囊結石組和膽管結石組中的GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA顯著高于對照組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01），但膽囊結石組與膽管結石組GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA 比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；膽囊結石組GCDCA 高于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05），但膽管結石組與對照組、膽囊結石組與膽管結石組之間GCDCA 比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 三組膽汁酸譜比較[nmol/L，M（P25，P75）]

3 討論

膽石癥是臨床上的一種多見病、常發病。多數患者并無明顯癥狀，常于健康體檢或其他疾病檢查時發現。但是膽結石的存在會對膽囊或膽管的正常結構和功能產生影響，如占位性的影響膽囊排空功能、結石嵌頓引起的膽絞痛、結石反復摩擦膽囊壁誘發膽囊炎等[2]。目前膽石癥的診斷和治療已相對成熟，但術后易出現諸多遠期并發癥[12]。有研究表明，膽囊切除術后部分患者腸道的細菌降解功能出現紊亂，直腸癌的發病率明顯提高[13-17]。除此以外，膽石癥患者術后結石的復發率較高[18]。多項研究顯示，膽總管結石患者經內鏡逆行膽胰管成像術后的復發率為4%～24%[19]，膽囊結石術后的復發率高達20%[20-23]。因此，對膽石癥形成的原因及預防的研究顯得尤為重要。

膽汁酸是膽固醇的代謝產物，是由24 個碳原子組成的膽烷酸衍生物，占人體總膽汁含量的50%～70%[24-25]。膽汁酸成分的改變是膽囊結石形成的主要原因之一[26]。在非疾病狀態下，血清中膽汁酸各亞型含量及比例基本恒定，其中CA 約占總膽汁酸的40%，CDCA 占40%，DCA 占18%，LCA 不足2%。在疾病狀態下，受肝細胞功能和膽汁酸肝腸循環的影響，血清中膽汁酸各亞型的種類及含量可能發生改變，膽固醇不能維持微膠粒狀態，逐漸形成結晶并析出，最終導致結石的形成。

本研究中筆者使用LC-MS/MS 法，對膽囊結石組、膽管結石組及對照組的血清膽汁酸譜進行檢測，發現三組GCA、GUDCA、GCDCA、TCA、TUDCA、TCDCA這6 種膽汁酸亞組分比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）；兩兩比較發現，膽囊結石組和膽管結石組中的GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA 顯著高于對照組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01），但膽囊結石組與膽管結石組GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；膽囊結石組GCDCA 高于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05），但膽管結石組與對照組、膽囊結石組與膽管結石組之間GCDCA 比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。本研究與相關報道[27-28]的結果基本一致，提示了本研究結果的可靠性。從以上結果可以看出，無論是膽囊結石組還是膽管結石組，其與對照組的膽汁酸譜都存在差異。其共同的差異膽汁酸為GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA，且波動趨勢一致，均比對照組增高。即此5 項指標與結石本身的位置無關，而與體內有無結石有關。由此可以推斷，GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA 這5 種膽汁酸組分可能為膽石癥診斷的標志性分子。另有研究表明[27]，膽汁酸各亞組分在膽石癥發生前，即超聲、CT 等結果正常時已有明顯的改變。因此，膽汁酸亞組分的檢測有望成為預測及診斷膽石癥的新型指標。

值得注意的是，本研究中，有差異的膽汁酸亞組分均為結合膽汁酸。這些差異膽汁酸亞組分在血清中與膽汁中是否一致尚未可知。對于兩者之間相互影響及轉化的過程中的影響因素還需要繼續研究。

綜上所述，本研究通過對血清中膽汁酸譜的檢測探討了膽汁酸代謝亞組分與膽石癥的關系，為膽石癥早期診斷及預防尋找可能的標志物。