替米沙坦對高糖狀態下血管內皮細胞胰島素敏感性的影響

占日新，華銘，金燕

（杭州市第九人民醫院，浙江 杭州 310000）

0 引言

胰島素抵抗（insulin resistance,IR）是指各種原因使胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降，常伴有高胰島素血癥，易導致代謝綜合征和2型糖尿病。內皮細胞和血管平滑肌細胞也對胰島素敏感，因為高密度的胰島素受體也存在內皮細胞和血管平滑肌細胞中，胰島素具有廣泛的生物學效應，在心血管系統也表現其作用，如胰島素的生理濃度可以調節血管張力和維持血管內皮的完整性。其作用機制是胰島素通過IRS-1/RAS/MAPK/ET-1和IRS-1/PI3K/Akt/NO間平衡協調發揮作用[1]。但高血糖，高脂血癥和高胰島素血癥等引起的病理狀態可以打破兩條通路間的平衡，出現IR和內皮功能失常現象，從而誘發心血管疾病，該病包括動脈粥樣硬化、高血壓和冠心病等[2]。有研究發現33mmol/L高糖可誘導血管內皮細胞IR，吡格列酮和羅格列酮激活PPARγ后能顯著改善高糖誘導血管內皮細胞IR癥狀[3]，替米沙坦能夠部分激動PPARγ作用[4]。Myojo M等[5]研究發現0.1μmol/L、1μmol/L或10μmol/L替米沙坦治療人臍靜脈內皮細胞后可顯著提高了eNOS的磷酸化水平，以濃度依賴的方式增加。本實驗從替米沙坦對高糖狀態下血管內皮細胞胰島素敏感性的影響展開研究。

1 材料

1.1 細胞株以及主要試劑

人臍靜脈血管內皮細胞株（中國醫學科學院），DMEM 培養基干粉（gibco）；替米沙坦（羅恩），NO、ET-1、IL-6及TNF-α試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 儀器

超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；MD-200-3 型電子天平（上海第三分析儀器廠）；酶聯免疫檢測儀（BIO-RAD，美國）；超低溫冰箱（Sanyo，日本）；Eppendorf 加樣器（Eppendorf，德國）；生物樣品均質機（法國BIRTIN，Precellys 24），生化培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠，SPC-150BZ），移液器（Eppendorf，Research）。

2 方法

2.1 實驗具體步驟

在細胞培養皿上均勻接種人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），隨機分為高糖組（HG）與替米沙坦處理組（HG+TM）共2組。HG組在含Glucose 33mmol/L的DMEM完全培養液培養48h[3]。HG+TM組先在含33mmol/L Glucose的DMEM完全培養液培養24h，然后在含替米沙坦500μg/L[5]+Glucose 33mmol/L完全培養液培養24h。按照上條件處理結束后，兩組細胞在含5.5mmol/L Glucose地DMEM（無血清）繼續培養4h，加入終濃度為5mIU/L胰島素繼續培養10min，最后將兩組細胞上清液進行收集，檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6、NO及ET-1水平進行比較。

2.2 檢測兩組人臍靜脈內皮細胞上清液NO水平

參照南京建成生物工程研究所NO檢測試劑盒的使用說明。稀釋標準品（1～100μM）采用DMEM＋10%FBS；樣品采用已處理人臍靜脈內皮細胞上清液，按照每孔50μl，將標準品及樣品加入在48孔板中；然后室溫中將Griess Reagent I加入各孔中；最后室溫中將Griess Reagent Ⅱ加入各孔中。用酶標儀在540nm波長下測定吸光度。先把稀釋標準品吸光度與濃度做出標準曲線，然后根據兩組人臍靜脈內皮細胞上清液吸光度推算出NO 水平。

2.3 檢測兩組人臍靜脈內皮細胞上清液E T-1、TNF-α、IL-6水平

按照南京建成生物工程研究所ET-1、TNF-α、IL-6檢測試劑盒里面步驟說明書實施雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。將標準品、樣品、HRP 標記的檢測抗體依次加入預先包被ET-1、TNF-α、IL-6抗體的包被微孔中，溫育后徹底洗滌完成后。最后用底物四甲基聯苯胺顯色，450nm測定吸光度，先做出標準曲線，然后根據兩組樣品吸光度計算樣品ET-1、TNF-α、IL-6水平。

2.4 統計學分析

應用SPSS 19.0軟件對數據進行統計學處理。組間計量資料比較采用t檢驗，以均數±標準差（）表示。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 兩組HUVECs上清液NO、ET-1水平比較

與HG組相比，HG+TM組NO水平升高和ET-1水平降低，差異具有統計學意義（t分別=9.70、-5.82，P＜0.01）。血管內皮細胞在Glucose 33mmol/L完全培養液培養48h后可引起胰島素抵抗[3]，而胰島素的生理濃度可以調節血管血管張力和維持血管內皮的完整性。其作用機制是胰島素通過IRS-1/RAS/MAPK/ET-1和IRS-1/PI3K/Akt/NO間平衡協調發揮作用的[1]。該結果表明替米沙坦可顯著增加高糖狀態下血管內皮細胞的胰島素敏感性，見表1。

表1 兩組TNF-α、IL-6水平比較（，n=3）

表1 兩組TNF-α、IL-6水平比較（，n=3）

注：與HG組比較，**P＜0.01。

3.2 兩組TNF-α、IL-6水平比較

與HG組相比，HG+TM組TNF-α、IL-6水平降低，差異具有統計學意義（t分別=-16.46、-4.68，P＜0.01）；表明替米沙坦可顯著降低高糖狀態下血管內皮細胞TNF-α、IL-6炎癥因子水平，如表2所示。

表2 兩組TNF-α、IL-6水平比較（，n=3）

表2 兩組TNF-α、IL-6水平比較（，n=3）

注：與HG組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

2型糖尿病（T2DM）的發病機制和IR的發生是由多種刺激因素引起的，特別是糖脂毒性、活性氧（ROS）的產生、各種轉錄介導通路的激活以及各種促炎細胞因子水平的增加。在各種促炎細胞因子中，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是最重要的促炎介質之一，它與胰島素抵抗的發展和T2DM的發病機制密切相關。TNF-α通過激活各種轉錄介導的途徑誘導組織特異性炎癥和參與ROS的生成。胰島素信號損害與TNF-α水平的升高通過絲氨酸磷酸化密切相關，而胰島素信號損害可引起IR，從而導致T2DM的發展。抗TNF-α治療策略已被開發以減少胰島素抵抗的發生率和T2DM的發展[6]。Akash MSH等研究發現，HepG2肝細胞中TNF-α下調后，有助于改善的胰島素刺激后的IRS-1磷酸化和胰島素反應[7]。白細胞介素-6（IL-6）是一種促炎細胞因子，通過控制分化、遷移、增殖和細胞凋亡，通過炎癥的產生，決定性地誘導胰島素抵抗的發生和2型糖尿病T2DM的發病。IL-6通過誘導胰島素信號通路潛在抑制劑SOCS-3的表達，使胰島素受體和胰島素受體底物-1的磷酸化受損，從而導致胰島素抵抗[8]。表明炎癥因子TNF-α、IL-6在IR中起到重要作用。吡格列酮和羅格列酮激活PPARγ后能顯著改善高糖誘導血管內皮細胞胰島素抵抗癥狀[3]，而替米沙坦作為PPARγ部分激動劑，有研究發現替米沙坦通過激活PPARγ來改善心肌重構[9]。替米沙坦具有部分PPARγ激動作用，同時避免了PPARγ激動劑（噻唑烷二酮類）的安全性問題。替米沙坦可能是一種替代治療方案，對糖尿病和高血壓有雙重好處，由此可見，替米沙坦通過部分PPARγ激動活性抗糖尿病作用將成為新的糖尿病的藥物治療方案[10]。替米沙坦還可以抑制晚期糖基化終末產物誘導的人臍靜脈內皮細胞炎性損傷，表現為降低晚期糖基化終末產物誘導的人臍靜脈內皮細胞VCAM-1和MCP-1水平[11]。本研究發現，替米沙坦可使得33mmol/L高糖狀態下血管內皮細胞NO水平升高，TNF-α、IL-6、ET-1水平下降。結果提示，替米沙坦可增加高糖狀態下血管內皮細胞胰島素敏感性，其機制可能降低TNF-α、IL-6炎癥因子水平有關。替米沙坦對高糖狀態下血管內皮細胞具有保護作用，有望用于預防糖尿病引起的血管病變。