結直腸癌組織中CISD2的表達及其對5-氟尿嘧啶化療敏感性的影響

曹會茹，徐陽，王華德，文普帥，2

（錦州醫科大學 1.基礎醫學院病理生理學教研室；2.生物人類學研究所，遼寧 錦州 121001）

研究［1］顯示，我國結直腸癌發病率及死亡率均較高。目前，結直腸癌廣泛使用的治療方法是5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）及以5-FU為基礎的聯合化療，但5-FU耐藥性限制了其在臨床中的應用［2］。因此，降低5-FU耐藥性，提高腫瘤對5-FU的敏感性是提高化療療效、改善結直腸癌的預后關鍵。CDGSH鐵硫結構域2（CDGSH iron-sulfur domain 2，CISD2）是CDGSH鐵硫結構域蛋白家族成員，具有調控線粒體完整性和功能、鈣代謝、氧化還原反應等作用［3］。研究證明，CISD2能增強乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力［4］；前列腺癌中高表達的CISD2能促進細胞的侵襲和遷移，并預示預后不良［5］；胃癌中CISD2增強癌細胞對5-FU的化療敏感性［6］。目前，關于CISD2對結直腸癌的作用及臨床意義研究未見報道。本研究探討結直腸癌組織中CISD2的表達，分析其表達水平與臨床指標的關系；同時探討CISD2表達對5-FU敏感性的影響及分子機制，旨在為改善5-FU治療結直腸癌的效果提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 組織細胞和主要試劑

選取錦州醫科大學附屬第一醫院普外科手術切除25例患者的新鮮結直腸癌與癌旁組織，癌旁組織為癌組織邊緣 ＞2 cm組織，于-80 ℃冰箱保存。納入標準：術前未接受過放療、化療，經病理診斷為結直腸癌。本研究經錦州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準（批號：201923），患者家屬知情同意。50例人結直腸癌組織微陣列由上海芯超生物技術有限公司完成。抗CISD2、caspase-3和β-actin抗體購自美國Proteintech公司；抗ATG5、Beclin 1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、AKT和p-AKT抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；反轉試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自加拿大Applied Biological Materials公司。

1.2 方法

1.2.1 Oncomine數據庫CISD2mRNA水平分析：分析Oncomine平臺（http：//www.oncomine.org）結直腸癌和匹配的正常組織中CISD2mRNA的表達水平，篩選標準為P＜ 0.05。

1.2.2 細胞培養和轉染：HCT116和HCT8腫瘤細胞株分別用含有10%的胎牛血清的McCoy 5A和L-15培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。取對數生長期的細胞，按Lipofectamine 3000轉染試劑盒方法轉染。

1.2.3 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）：TRIzol試劑提取組織中的RNA，采用反轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，采用熒光定量PCR試劑盒和ABI 7500實時PCR系統進行定量PCR反應，重復實驗3次，以18S rRNA為內參；CISD2，正向引物5’-CACCGAGTCGTAGTCGAG GT-3’，反向引物5’-TTTCGGGTAGTGGAAAACC A-3’；18S rRNA，正向引物5’-GTAACCCGTTGAAC CCCATT -3’，反向引物5’-CCATCCAATCGGTAGTA GCG-3’。CISD2的表達水平采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.4 免疫組化檢測：人結直腸癌組織芯片經烘蠟、脫蠟、抗原修復、一抗孵育、封閉、二抗孵育、染色后，每個切片隨機選擇5個視野，Image J軟件評估各視野CISD2平均光密度（average optical density，AOD）來判定CISD2的表達水平，AOD=積分光密度/面積。各視野下的染色強度及陽性細胞百分比評價：0分，無著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽性細胞0～5%，0分；6%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；76%～100%，4分。染色強度及陽性細胞百分比評分之和記為總分，0～2分為CISD2陰性表達，3～7為CISD2陽性表達。

1.2.5 MTT法檢測細胞活力：將細胞分為對照組（轉染空載質粒）、過表達CISD2組（轉染CISD2表達質粒）、單純5-FU處理組（10 μmol/L或20 μmol/L 5-FU處理24 h）、過表達CISD2和5-FU聯合組（轉染CISD2表達質粒，同時給予10 μmol/L或20 μmol/L 5-FU處理24 h）。取各組5×103個細胞懸液接種于96孔板，加入20 μL MTT試劑后，置于37 ℃培養箱中4 h，測定波長570 nm的吸光度（optical density，OD）值。

1.2.6 Western blotting檢測：取對照組、過表達CISD2組、單純5-FU處理組、過表達CISD2和5-FU聯合組的蛋白樣品經電泳分離，轉膜、封閉，4 ℃孵育β-actin、CISD2、ATG5、Beclin 1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、AKT和p-AKT一抗，過夜，次日洗膜、二抗孵育、ECL顯色、利用Image J軟件分析各組條帶灰度值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 18.0 軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料以表示，2組比較采用t檢驗分析，計數資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織及癌旁組織中CISD2的表達及其與臨床病理特征的關系

qRT-PCR結果顯示，結直腸癌組織中CISD2mRNA表達水平為0.03±0.06，明顯低于癌旁組織（1.02±0.32，P＜ 0.000 1，圖1A）。Oncomine數據庫多個結直腸數據集樣本中CISD2mRNA水平也明顯降低（圖1B）。

免疫組化染色結果顯示，CISD2主要定位于細胞質中。與癌旁組織（0.39±0.06）比較，CRC組織（0.35±0.04）CISD2表達顯著減少（P＜ 0.01），見圖1C、1D。

圖1 結直腸癌組織及癌旁組織中CISD2的表達Fig.1 CISD2 expression in colorectal cancer（CRC）tissues and adjacent non-cancer tissues

2.2 結直腸癌組織中CISD2表達及其與患者臨床指標的關系

結果顯示，CISD2的表達陽性率與M期（P=0.03）相關，而與性別、年齡、TNM分期、T期、N期和淋巴結總數不相關，見表1。

表1 結直腸癌中CISD2的表達與各臨床指標的關系Tab.1 Relationships between CISD2 expression in colorectal cancer tissue and clinical indices

2.3 CISD2的表達對結直腸癌細胞5-FU敏感性的影響

MTT實驗結果顯示，10、20 μmol/L5-FU處理HCT8細胞后，細胞活力分別為0.19±0.02和0.17±0.03，與對照組（0.33±0.02）比較，CRC細胞活力下降（t=10.50，P＜ 0.000 1；t=9.45，P＜ 0.000 1；圖2A）；CISD2過表達聯合5-FU（10、20 μmol/L）作用細胞時，細胞活力分別為0.16±0.01和0.12±0.01，顯著低于單純5-FU處理組細胞活力（t=3.58，P＜ 0.01；t=7.04，P＜0.000 1），見圖2A。HCT116細胞中的實驗結果與HCT8細胞類似，見圖2B。

圖2 過表達CISD2對結直腸癌細胞5-FU敏感性的影響Fig.2 Effect of overexpression of CISD2 on the sensitivity of colorectal cancer cells to 5-FU

2.4 5-FU對結直腸癌細胞CISD2表達的影響

Western blotting結果顯示，在HCT8和HCT116細胞中，與對照組比較，5、10、20 μmol/L 5-FU處理24 h后CISD2蛋白水平顯著升高，差異均有統計學意義（均P＜ 0.05），見圖3、表2。

表2 5-FU對結直腸癌細胞中CISD2表達的影響Tab.2 Effect of 5-FU on CISD2 expression in colorectal cancer cells

圖3 5-FU誘導結直腸癌細胞中CISD2的表達Fig.3 Effects of 5-FU treatment on expression of CISD2 in colorectal cancer cells

2.5 CISD2對結直腸癌細胞ATG5、Beclin 1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、caspase-3、活化caspase-3、AKT和p-AKT表達水平的影響

結果顯示，與對照組HCT8和HCT116細胞比較，單純5-FU處理組細胞中自噬蛋白Beclin 1、ATG5和LC3-Ⅱ/Ⅰ顯著增高。與單純5-FU處理組HCT8和HCT116細胞相比，過表達CISD2聯合5-FU處理組細胞中Beclin 1、ATG5和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平降低而凋亡蛋白活化的caspase-3表達水平明顯增高。與對照組HCT8和HCT116細胞相比，單純5-FU處理組細胞中p-AKT表達水平降低；而與單純5-FU處理組相比，過表達CISD2聯合5-FU處理組細胞中p-AKT表達升高，見圖4，表3、4。

表3 CISD2對5-FU誘導HCT8細胞自噬、凋亡相關蛋白的影響Tab.3 Effects of CISD2 on 5-FU-induced autophagy and apoptosis-related proteins in HCT8 cells

圖4 CISD2對5-FU誘導結直腸癌細胞自噬和凋亡相關蛋白的影響Fig.4 Effect of CISD2 on 5-FU-induced autophagy and apoptosis-related proteins in colorectal cancer cells

3 討論

CISD2與多種腫瘤的發生與演進密切相關。CISD2能激活Wnt/β-catenin信號通路促進胰腺癌細胞增殖［7］；CISD2缺失能抑制神經母細胞瘤細胞增殖和分化；WANG等 ［8］發現胃癌中CISD2表達水平增高，并調控AKT途徑促進癌細胞增殖，這些研究提示CISD2在腫瘤中扮演癌基因的作用。但也有研究結果與之相悖，SUN等［6］發現胃癌中CISD2的表達水平顯著下調，并能增強胃癌細胞對5-FU的敏感性。由此可見，CISD2在腫瘤中的角色仍有爭議。本研究發現，CISD2在結直腸癌組織中表達顯著下調，與結直腸癌患者的M分期有關。同時，CISD2可能通過AKT通路抑制自噬而增強結直腸癌細胞對5-FU的敏感性。

表4 CISD2對5-FU誘導HCT116細胞自噬、凋亡相關蛋白的影響Tab.4 Effects of CISD2 on 5-FU-induced autophagy and apoptosis-related proteins in HCT116 cells

當前，5-FU仍然是結直腸癌治療不可或缺的藥物。自5-FU廣泛用于Ⅰ期結直腸癌治療后，5-FU/亞葉酸治療方案已成為結直腸癌標準治療方案［9］。但是，5-FU的耐藥性也成為治療失敗的主要原因。細胞自噬是真核生物中進化保守的、對細胞內物質進行周轉利用的重要過程［10］。研究［11］表明，癌細胞可依賴自噬來進行細胞保護以應對不利的微環境，如營養缺乏、缺氧、缺乏生長因子、存在化療或某些靶向療法介導的耐藥性等。因此，自噬抑制劑聯合5-FU治療在癌癥治療中展現出巨大潛力。5-FU聯合自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤顯著提高5-FU在肺癌和結直腸癌的治療效果［9，12］。本研究發現，5-FU處理結直腸癌細胞時，自噬相關蛋白ATG5、Beclin 1和LC3-Ⅱ/Ⅰ水平增高，提示5-FU引起了結直腸癌細胞的自噬，而過表達CISD2顯著抑制了5-FU誘導的結直腸癌細胞中的自噬過程，這也與胃癌中CISD2的作用一致［6］。因此，CISD2可作為潛在的干預靶點來解決5-FU耐藥性問題。

研究［13］發現，PI3K/Akt/mTOR信號通路是抑制自噬的主要途徑。外界信號刺激誘導PI3K調節亞基p85的SH2結構域磷酸化，催化亞基p110解除抑制而激活PI3K，而引起AKT第308位點蘇氨酸和473位點絲氨酸磷酸化，活化后的AKT 激活mTOR而抑制自噬［14］。研究顯示，PI3K/AKT/mTOR途徑調控細胞自噬而影響腫瘤對5-FU藥物的敏感性。TSPAN9下調PI3K/AKT/mTOR途徑激活自噬而降低胃癌細胞對5-FU的敏感性［15］；辣椒素顯著增加膽管癌細胞對5-FU敏感性，其機制是辣椒素激活PI3K/AKT/mTOR途徑而抑制5-FU激活的自噬［16］；胃癌細胞中CISD2也經PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制5-FU誘導的自噬而增強癌細胞對5-FU的敏感性［6］。本研究中CISD2逆轉了5-FU下調AKT磷酸化的作用，并抑制5-FU誘導的結直腸癌細胞自噬過程，提示CISD2可能經PI3K/AKT/mTOR途徑抑制自噬而增強結直腸癌細胞對5-FU的敏感性。

綜上所述，本研究發現CISD2在結直腸癌組織中表達下調，其過表達能增強結直腸癌對5-FU的敏感性，此作用可能是通過激活AKT/mTOR通路抑制自噬而實現的。靶向CISD2可能增加結直腸癌組織對5-FU的化療敏感性，同時也可能是解決5-FU耐藥問題的潛在方向。